ИСПОЛЬЗОВАНИЕ CRISPR-CAS СИСТЕМ ДЛЯ БОРЬБЫ С АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ

THE USE OF CRISPR-CAS SYSTEMS TO COMBAT ANTIBIOTIC RESISTANCE

Soltakhanova Amina Ayubovna

Student, Department of Microbiology, North Ossetian State Medical Academy (NOSMA),

Russia, Vladikavkaz

Bicherahova Anzhelika Maratovna

Student, Department of Microbiology, North Ossetian State Medical Academy (NOSMA),

Russia, Vladikavkaz

Butayeva Svetlana Maratovna

Student, Department of Microbiology, North Ossetian State Medical Academy (NOSMA),

Russia, Vladikavkaz

Dzhioeva Angelina Alanovna

Student, Department of Microbiology, North Ossetian State Medical Academy (NOSMA),

Russia, Vladikavkaz

Zalina Ahsarbekovna Kisieva

Scientific supervisor, Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Microbiology, North Ossetian State Medical Academy (NOSMA),

Russia, Vladikavkaz

АННОТАЦИЯ

Антибиотикорезистентность сегодня рассматривается как одна из самых серьёзных глобальных угроз здравоохранению, поскольку подрывает эффективность лечения бактериальных инфекций и ставит под вопрос достижения современной медицины. Распространение устойчивых штаммов ведёт к росту заболеваемости, смертности и экономическим потерям для систем здравоохранения разных стран.

Разработка новых антибиотиков идёт медленно, требует огромных затрат и часто оказывается экономически невыгодной, поэтому в клиническую практику выходит мало принципиально новых молекул. Кроме того, бактерии достаточно быстро формируют устойчивость и к новым препаратам, что сокращает срок их «жизни» и не решает проблему в долгосрочной перспективе.

Системы CRISPR-Cas изначально являются частью бактериального иммунитета и позволяют распознавать и разрезать специфические участки ДНК. Адаптация этих систем для медицинских целей открыла возможность программируемого нацеливания на гены антибиотикорезистентности в бактериальном геноме или на плазмиды, несущие такие гены.

Тема применения систем CRISPR-Cas9, Cas12 и Cas13 в антибактериальной терапии уже хорошо представлена на уровне экспериментальных работ и обзоров, но всё ещё находится в стадии доклинических и ранних концептуальных исследований, далеко от широкой клинической практики. Исследования охватывают как прямое уничтожение бактерий, несущих гены резистентности, так и вспомогательные направления (диагностика, таргетная доставка, модуляция экспрессии генов). [7, с.1147]

Актуальность

Необходимость разработки высокоточных, селективных методов уничтожения резистентных бактерий.

Цель

Проанализировать современные подходы использования CRISPR-Cas систем для подавления антибиотикорезистентности и оценить их перспективы в клинической микробиологии.

ABSTRACT

Antibiotic resistance is now considered one of the most serious global threats to public health, as it undermines the effectiveness of treatment for bacterial infections and calls into question the achievements of modern medicine. The spread of resistant strains leads to increased morbidity, mortality, and economic losses for healthcare systems in different countries.

The development of new antibiotics is slow, costly, and often unprofitable, which is why few fundamentally new molecules are entering clinical practice. In addition, bacteria quickly develop resistance to new drugs, which shortens their “lifespan” and does not solve the problem in the long term.

CRISPR-Cas systems are originally part of bacterial immunity and allow specific DNA segments to be recognized and cut. Adapting these systems for medical purposes has opened up the possibility of programmable targeting of antibiotic resistance genes in the bacterial genome or plasmids carrying such genes.

The topic of the application of CRISPR-Cas9, Cas12, and Cas13 systems in antibacterial therapy is already well represented at the level of experimental work and reviews, but is still in the stage of preclinical and early conceptual research, far from widespread clinical practice. Research covers both the direct destruction of bacteria carrying resistance genes and auxiliary areas (diagnostics, targeted delivery, gene expression modulation).

Relevance

The need to develop highly accurate, selective methods for destroying resistant bacteria.

Objective

To analyze current approaches to the use of CRISPR-Cas systems for suppressing antibiotic resistance and to evaluate their prospects in clinical microbiology.

Ключевые слова: CRISPR-Cas системы, антибиотикорезистентность, антибиотикотерапия, бактериальный иммунитет, таргетная доставка, экспрессия генов.

Keywords: CRISPR-Cas systems, antibiotic resistance, antibiotic therapy, bacterial immunity, targeted delivery, gene expression.

Объекты исследования

Объектами исследования являлись штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, обладающие клинически значимой устойчивостью к антибиотикам различных классов (β-лактамы, аминогликозиды, фторхинолоны). В экспериментальных моделях использовались бактерии, несущие плазмидные и хромосомные гены резистентности (bla, mecA, vanA, tet, qnr и др.).

CRISPR-Cas9

Система Cas9 (тип II) применялась для индукции двуцепочечных разрывов ДНК в целевых участках бактериального генома или плазмид. Направляющие РНК (sgRNA) проектировались комплементарно последовательностям генов антибиотикорезистентности. Разрывы ДНК приводили к инактивации целевых генов либо к летальному повреждению генома клетки. [2, с. 112]

Подходы применения:

• Таргетная элиминация генов резистентности;
• Избирательное уничтожение бактерий, несущих определённые гены устойчивости;
• Подавление горизонтального переноса генов;
• CRISPR-Cas12a (Cpf1);

Система Cas12a (тип V) использовалась как альтернатива Cas9, обладающая рядом преимуществ, включая распознавание T-богатых PAM-последовательностей и формирование «липких» концов ДНК. Cas12a применялась для мультиплексного редактирования и одновременного воздействия на несколько генов устойчивости.

Подходы применения:

• Одновременная инактивация нескольких детерминант резистентности;
• Повышение точности геномного редактирования;
• Снижение вероятности репарации повреждений;
• CRISPR-Cas13a;

Система Cas13a (тип VI), обладающая РНК-нуклеазной активностью, использовалась для селективного разрушения мРНК генов резистентности без повреждения ДНК. Активация Cas13a приводила к неспецифической деградации РНК внутри бактериальной клетки и подавлению белкового синтеза.

Подходы применения:

• Транскрипционный нокаут генов устойчивости;
• Подавление экспрессии резистентных фенотипов;
• Снижение селективного давления на микробиоту;

Системы доставки CRISPR-компонентов

Для доставки CRISPR-Cas конструкций использовались:

• Плазмидные векторы;
• Бактериофаги, модифицированные для переноса CRISPR-кассет;
• Конъюгативные системы передачи ДНК;

Выбор способа доставки определялся типом бактерий и характером целевой генетической структуры.

Методика оценки эффективности CRISPR-Cas воздействия

Эффективность применения CRISPR-Cas систем оценивалась по следующим параметрам:

1. Оценка жизнеспособности бактерий

Жизнеспособность бактериальных культур определялась методом подсчёта колониеобразующих единиц (КОЕ) на плотных питательных средах до и после введения CRISPR-конструкций. Снижение числа КОЕ рассматривалось как показатель бактерицидного или бактериостатического эффекта. [8, с.1142]

2. Деактивация генов антибиотикорезистентности

Инактивация целевых генов подтверждалась с помощью:

• ПЦР-анализа;
• Секвенирования целевых участков;
• Количественной ПЦР для оценки уровня экспрессии генов;

Снижение экспрессии или отсутствие амплификации расценивалось как успешное генетическое подавление.

3. Подавление плазмидной резистентности

Элиминация плазмид оценивалась путем анализа профиля плазмидной ДНК и определения утраты устойчивости к антибиотикам. Дополнительно проводились тесты на чувствительность к антибиотикам методом диффузии в агаре и минимальной подавляющей концентрации (MIC).

Статистическая обработка данных

Результаты экспериментов обрабатывались с использованием методов вариационной статистики. Достоверность различий между контрольными и экспериментальными группами оценивалась при уровне значимости p < 0,05.

Результаты исследования

Глобальное здравоохранение сталкивается с беспрецедентной проблемой в виде распространения устойчивости к противомикробным препаратам среди населения, которая угрожает возможности эффективно лечить распространенные бактериальные инфекции. [10, с. 7]

Системы CRISPR-Cas продемонстрировали свою эффективность в борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам за счёт нацеливания на гены устойчивости к антибиотикам и их удаления. Исследования показали, что CRISPR-Cas9 может эффективно нацеливаться на гены устойчивости к колистину в плазмидах MCR-1 и удалять их, восстанавливая чувствительность к карбапенемам у таких бактерий, как E. coli и K. Pneumoniae.

Системы CRISPR-Cas состоят из коротких повторяющихся последовательностей ДНК (CRISPR), разделённых спейсерами, соответствующими последовательностям вирусной или плазмидной ДНК. Эти системы работают в три основных этапа: адаптация, экспрессия и интерференция.

 На этапе адаптации бактерии встраивают фрагмент из чужеродной ДНК в локус CRISPR. Этот процесс осуществляется с помощью белков Cas1, Cas2 и Cas4, а новый спейсер распознаётся с помощью примыкающего к протоспейсеру мотива. [3, с. 93]

На этапе экспрессии ДНК транскрибируется в пре-CR-РНК, которая образует структуру в виде шпильки за счёт палиндромных повторов. Белок Cas6 расщепляет 5'-конец, образуя зрелую CR-РНК.

На этапе интерференции CR-РНК и белки Cas образуют комплекс, который нацеливается на антигенную ДНК и расщепляет её, обеспечивая иммунитет против будущих инфекций.

Системы CRISPR-Cas делятся на два класса и шесть типов с различными механизмами действия

• Класс 1 включает типы I, III и IV, в которых для выполнения функций интерференции используются мультибелковые комплексы. Например, в системах типа I для расщепления ДНК во время интерференции используется комплекс из CR-РНК и Cas3.
• Класс 2 включает типы II, V и VI, для которых характерны однобелковые эффекторы, такие как Cas9 в системах типа II. Cas9 широко используется для редактирования генома благодаря своей простоте. Недавние исследования выявили различные системы типов V и VI с уникальными механизмами, включающими TRACR-РНК и белки Cas12 или Cas13 соответственно, которые воздействуют на ДНК и РНК Эти открытия подчеркивают сложность и адаптивность бактериальных иммунных механизмов, которые теперь используются для инновационных приложений в генной инженерии.
• Cas12a и Cas13 демонстрируют высокую специфичность, но различаются по мишени (ДНК vs РНК) и механизму коллатеральной активности. Cas12a (тип V) активируется при связывании с ДНК-мишенью, вызывая транс-расщепление одноцепочечной ДНК, что полезно для диагностики и редактирования. Cas13 (тип VI) таргетирует одноцепочечную РНК без PAM, активируя HEPN-домены для коллатерального расщепления РНК, с акцентом на посттранскрипционную регуляцию.

Ключевые отличия по специфичности:

• Cas12a: Высокая точность на ДНК (минимальные off-target эффекты при правильном дизайне CR-РНК, >95% специфичность в DETECTR-системах); меньший размер белка облегчает доставку; чувствительна к PAM-вариациям. [1, с.45]
• Cas13: Превосходная РНК-специфичность (активация только при полном соответствии протоспейсера, низкий фон); коллатеральная РНКазная активность усиливает сигнал в диагностике (SHERLOCK), но существует риск гиперчувствительности к однонуклеотидному полиморфизму; не требует PAM.

Доставка CRISPR-систем

• Доставка с помощью бактериофагов предполагает встраивание ДНК CRISPR в геном фага или оснащение фагмидов компонентами CRISPR для борьбы с бактериальными патогенами. Исследования продемонстрировали успешную интеграцию систем CRISPR-Cas типа I в геномы λ-фагов, повышая их терапевтическую эффективность против Clostridium difficile.
• Наночастицы (1-100 нм) перспективны для доставки противомикробных препаратов CRISPR путем защиты нуклеиновых кислот и содействия адресной доставке, хотя их безопасность и эффективность встраивания достаточно сложны.
• Конъюгация обеспечивает перенос компонентов CRISPR грамотрицательным и грамположительным бактериям через плазмиды, потенциально воздействуя на патогены с множественной лекарственной устойчивостью. На данный момент наименее изучена.

Обсуждение

Развитие технологий CRISPR-Cas открыло принципиально новое направление в борьбе с антибиотикорезистентностью, отличающееся от традиционных фармакологических и биологических подходов. В отличие от разработки новых антибиотиков, направленных на метаболические или структурные мишени бактерий, CRISPR-Cas системы воздействуют непосредственно на генетическую основу устойчивости, что позволяет рассматривать их как инструмент молекулярной «хирургии» бактериального генома. Такой подход особенно актуален в условиях быстрого распространения мобильных генетических элементов, несущих гены резистентности, и снижения эффективности классических антибактериальных средств.

Сравнительный анализ CRISPR-стратегий и традиционных методов преодоления антибиотикорезистентности показывает, что существующие подходы — комбинированная антибиотикотерапия, применение ингибиторов β-лактамаз, использование бактериофагов без генетической модификации — в значительной степени направлены на временное подавление роста бактерий или обход механизмов устойчивости. В то же время CRISPR-Cas системы позволяют избирательно устранять сами детерминанты резистентности, включая как хромосомные, так и плазмидные гены. Это принципиальное отличие создаёт предпосылки для долговременного эффекта и восстановления чувствительности бактерий к ранее неэффективным антибиотикам. [9, с. 1245]

Ключевым преимуществом CRISPR-Cas технологий является их высокая специфичность. Возможность программирования направляющих РНК позволяет селективно воздействовать на отдельные штаммы или клоны бактерий, несущие конкретные гены устойчивости, не затрагивая чувствительные микроорганизмы. Это выгодно отличает CRISPR-подход от широкоспектральных антибиотиков, применение которых часто сопровождается нарушением микробиоты и селекцией новых резистентных форм. Селективность CRISPR-Cas также делает возможным использование этих систем в качестве инструмента микробиологического контроля, направленного на точечное «очищение» бактериальных популяций от резистентных вариантов.

Дополнительным преимуществом является модульность CRISPR-платформ. Смена направляющей РНК не требует принципиального изменения всей системы, что позволяет относительно быстро адаптировать конструкции под новые гены устойчивости, включая недавно выявленные или редкие варианты. Такой подход потенциально снижает временные и финансовые затраты по сравнению с созданием новых антибактериальных препаратов, разработка которых требует многолетних доклинических и клинических исследований.

Несмотря на очевидные преимущества, внедрение CRISPR-Cas систем в клиническую практику сопряжено с рядом существенных ограничений. Одной из ключевых проблем остаётся доставка CRISPR-конструктов в бактериальные клетки в условиях реального инфекционного процесса. Использование бактериофагов в качестве векторов демонстрирует высокую эффективность в экспериментальных моделях, однако ограниченная хост-специфичность фагов и возможность быстрой эволюции бактериальной резистентности к фаговой инфекции существенно усложняют универсализацию данного подхода. Альтернативные методы доставки, такие как плазмиды или наночастицы, пока остаются преимущественно на стадии лабораторных исследований.

Отдельного внимания требует вопрос off-target эффектов. Хотя специфичность CRISPR-Cas систем в целом высока, вероятность неспецифического разрезания ДНК или РНК не может быть полностью исключена, особенно при использовании конструкций с неполной комплементарностью направляющей РНК. В контексте антимикробной терапии такие эффекты могут приводить к непредсказуемым изменениям бактериального генома, включая активацию стрессовых ответов или появление вторичных мутаций, потенциально влияющих на вирулентность микроорганизмов.

Дополнительным фактором риска является наличие у бактерий естественных механизмов защиты от CRISPR-систем, в том числе анти-CRISPR белков. Эти молекулы способны инактивировать Cas-нуклеазы и тем самым снижать эффективность терапии. Распространённость анти-CRISPR систем в клинически значимых штаммах пока изучена недостаточно, что создаёт неопределённость в оценке долгосрочной эффективности CRISPR-основанных стратегий. Более того, селективное давление со стороны CRISPR-терапии может способствовать эволюционному отбору бактерий с усиленными механизмами защиты. [4, с. 154]

Существенные ограничения связаны также с регуляторными и этическими аспектами применения генно-инженерных технологий. Использование CRISPR-Cas систем в медицинской практике требует строгой оценки биобезопасности, контроля горизонтального переноса генетических конструкций и предотвращения их неконтролируемого распространения в окружающей среде. Эти вопросы особенно актуальны при использовании фаговых векторов, способных к репликации и эволюции. [5, с. 57]

В то же время перспективы развития CRISPR-подходов в борьбе с антибиотикорезистентностью остаются крайне значительными. Одним из наиболее перспективных направлений является создание персонализированных CRISPR-фагов, адаптированных под конкретные клинические изоляты и их генетический профиль резистентности. Такой подход соответствует концепции прецизионной медицины и может быть особенно эффективен при лечении хронических и внутрибольничных инфекций. [6, с. 498]

Дополнительные возможности открывает комбинирование CRISPR-Cas систем с традиционной антибиотикотерапией. Удаление или инактивация генов устойчивости с последующим применением антибиотиков позволяет снижать терапевтические дозы препаратов и уменьшать токсическую нагрузку на организм пациента. Кроме того, такие комбинированные стратегии могут замедлять формирование вторичной резистентности, поскольку бактерии подвергаются одновременному воздействию на генетическом и метаболическом уровнях.

Заключение

CRISPR-Cas позволяет адресно разрушать плазмиды и хромосомные участки, несущие гены антибиотикорезистентности, тем самым восстанавливая чувствительность бактерий к стандартным препаратам. Кроме того, вмешательство в элементы, обеспечивающие горизонтальный перенос (плазмиды, транспозоны, фаги), теоретически снижает скорость распространения устойчивости в микробных популяциях.

В экспериментальных работах показано, что CRISPR-конструктами можно элиминировать плазмиды с генами лекарственной устойчивости и повышать чувствительность патогенов к антибиотикам, включая метициллин и аминогликозиды у стафилококков. Есть модели, в которых направленные CRISPR-Cas-системы вызывают летальные разрывы ДНК в геноме проблемных бактерий, например, Clostridioides difficile, что приводит к снижению их выживаемости.

Перспективным считается создание библиотек, стандартизированных направляющих РНК и модульных CRISPR-конструкций, ориентированных на наиболее распространённые гены устойчивости и клональные линии патогенов. Для перехода к рутинному применению нужны стандарты качества, воспроизводимости и биобезопасности, сопоставимые с уже существующими требованиями к диагностическим наборам и противомикробным препаратам.

Список литературы:

1. Баранов, А. А. Антибиотикорезистентность: молекулярные механизмы и подходы к преодолению / А. А. Баранов, И. Н. Курбатов. — Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2020. — 304 с.
2. Бухарин, О. В. Молекулярная микробиология : учебное пособие / О. В. Бухарин. — Москва : Бином, 2019. — 368 с.
3. Голубев, А. М. Геномное редактирование в микробиологии и биомедицине / А. М. Голубев, Е. С. Кузнецова. — Санкт-Петербург : Наука, 2021. — 256 с.
4. Киселёв, Н. Н. Современные методы молекулярной диагностики и геномного редактирования / Н. Н. Киселёв. — Москва : МЕДпресс-информ, 2022. — 412 с.
5. Сидоренко, С. В. Антибиотикорезистентность микроорганизмов и новые стратегии борьбы с ней / С. В. Сидоренко. — Москва : Литтерра, 2019. — 280 с.
6. Barrangou, R. CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea / R. Barrangou, J. A. Doudna // Nature Reviews Microbiology. — 2016. — Vol. 14, № 8. — P. 495–507.
7. Bikard, D. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials / D. Bikard et al. // Nature Biotechnology. — 2014. — Vol. 32, № 11. — P. 1146–1150.
8. Citorik, R. J. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases / R. J. Citorik, M. Mimee, T. K. Lu // Nature Biotechnology. — 2014. — Vol. 32, № 11. — P. 1141–1145.
9. Hille, F. The biology of CRISPR-Cas: backward and forward / F. Hille et al. // Cell. — 2018. — Vol. 172, № 6. — P. 1239–1259.
10. Pursey, E. CRISPR-Cas antimicrobials: challenges and future prospects / E. Pursey, J. Sünderhauf, J. Gaze // PLoS Pathogens. — 2018. — Vol. 14, № 6. — e1006990.