ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДСТВЕННЫХ ПРИМЕСЕЙ МЕТОДОМ ВЭЖХ В СУБСТАНЦИИ С ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПО ОТНОШЕНИЮ К ГРИППУ А, В И SARS-COV-2

VALIDATION OF THE ANALYTICAL PROCEDURE FOR THE DETERMINATION OF RELATED IMPURITIES BY HPLC METHOD IN SUBSTANCES WITH ANTIVIRAL ACTIVITY AGAINST INFLUENZA A, B AND SARS-CoV-2

Evgenia Maksimova

Student, Department of Chemical Technology of Biologically Active Substances and Polymer Composites, Yaroslavl State Technical University,

Russia, Yaroslavl

Natalia Krasnikova

Scientific supervisor, сandidate of Chemical Sciences, associate professor, Yaroslavl State Technical University,

Russia, Yaroslavl

АННОТАЦИЯ

При оценке устойчивости продемонстрирована пригодность методики родственные примеси методом ВЭЖХ в активной фармацевтической субстанции с противовирусным действием для выбранных условий (оборудование, реактивы, хроматографическая колонка, температура колонки, скорость потока). Этот вывод сделан на основании соответствия полученных данных в результате изменения параметров температуры колонки и скорости потока.

ABSTRACT

When evaluating stability, the suitability of the HPLC related impurities in active pharmaceutical ingredient with antiviral activity for the selected conditions (equipment, reagents, chromatographic column, column temperature, flow rate) was demonstrated. This conclusion was made based on the agreement between the data obtained as a result of changing the parameters of the column temperature and flow rate. 

Ключевые слова: активная фармацевтическая субстанция, валидация аналитической методики, родственные примеси, устойчивость.

Keywords: active pharmaceutical substance, analytical method validation, related impurities, robustness.

Мною проводились исследования качества АФС противовирусного действия, обладающего противовирусной активностью против лабораторных штаммов вирусов гриппа А и В и ингибирующего вирус SARS-CoV-2, вызывающий новую коронавирусную инфекцию (COVID-19).

При валидации аналитической методики по показателю «Родственные примеси» необходимо было провести оценку устойчивости.

При оценке устойчивости изучается степень влияния условий, которые могут повлиять на точность результатов, получаемых при выполнении той или иной методики. При разработке методики проводится также проверка пригодности хроматографической системы (ППХС) [1, c. 91]. Устойчивость, как правило, выражается в виде отсутствия подверженности результатов испытания воздействию изменений условий применения аналитической методики, связанных с окружающей средой. Если результаты измерений подвержены воздействию изменений условий применения методики, необходимо обеспечить надлежащий контроль таких условий либо включить в описание методики соответствующее предупреждение [2, с. 150, 152].

Необходимо подтвердить, что небольшие изменения в условиях хроматографирования не влияют на получаемые результаты. Методика считается устойчивой, если: при изменении температуры колонки в пределах ± 5 ºС, при изменении скорости потока в пределах ± 0,1 мл/мин выполняются требования ППХС (снижение количества теоретических тарелок не более чем на 50 %).

В ходе работы использовались следующие реактивы и оборудование: весы аналитические СЕ224-С ООО «Сартогосм», ВЭЖХ Agilent 1220 Infinity LC, pH-анализатор Hanna, УЗ-ванна ODA-LD30, калия дигидрофосфат PanReac, натрия карбонат безводный PanReac, фосфорная кислота концентрированная PanReac, ацетонитрил для хроматографии PanReac, вода для хроматографии, шприцы медицинские стерильные одноразовые 20 мл (0,8 мм х 38 мм) «Медфарм», фильтр мембранный, диаметр пор 0,45 мкм Gluvex.

В качестве подвижной фазы А использовалась смесь калия дигидрофосфата и воды для хроматографии в соотношении 5:95 (скорость потока 1 мл/мин). В качестве подвижной фазы Б использовался ацетонитрил для хроматографии (скорость потока 1 мл/мин). В методике производителя рекомендуется колонка 150x4,6 мм с размером частиц 3 мкм «YMC-Pack Pro C18». В качестве детектора использовался спектрофотометрический детектор с длиной волны 225 нм.

Полученная хроматограмма испытуемого раствора (АФС противовирусного действия) приведена на рисунке 1.

Рисунок 1. Хроматограмма испытуемого раствора

При проведении методики при стандартных условиях хроматографирования, а именно, при скорости потока - 1,0 мл/мин и температуре термостата колонки – 35 ºС были получены следующие результаты: эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику АФС противовирусного действия (при норме не менее 10000 теоретических тарелок) - 27771 т.т.; фактор ассиметрии (As) пика АФС противовирусного действия (при норме от 0,8 до 1,5) - 1,2; отношение сигнал/шум (S/N) для пика АФС противовирусного действия (при норме не менее 10): 13.

При изменении условий хроматографирования, а именно, при изменении температуры колонки в 30 ºС и 40 ºС были получены следующие результаты соответственно: эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику АФС противовирусного действия: 28765 т.т. и 26341 т.т.; фактор ассиметрии (As) пика АФС противовирусного действия: 1,1 и 1,1; отношение сигнал/шум (S/N) для пика АФС противовирусного действия: 23 и 48.

При изменении условий хроматографирования, а именно, при изменении скорости потока 1,1 мл/мин и 0,9 мл/мин были получены следующие результаты соответственно: эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику АФС противовирусного действия: 25442 т.т. и 27389 т.т.; фактор ассиметрии (As) пика АФС противовирусного действия: 1,0 и 1,1; отношение сигнал/шум (S/N) для пика АФС противовирусного действия: 39 и 21.

Таким образом изменение температуры колонки в пределах ± 5 ºС, скорости потока в пределах ± 0,1 мл/мин не оказывает значительное влияние на хроматографическую систему и позволяет получить достоверные результаты. Снижение количества теоретических тарелок менее чем на 50 %, что удовлетворяет критериям пригодности хроматографической системы. В ходе испытаний доказано соответствие критериям приемлемости на оценку устойчивости.

Список литературы:

1. Аладышева Ж.И., Береговых В.В. Валидация аналитических методик. / 2005 г. [электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http://www.fptl.ru/biblioteka/validaciya-metodik/aladisheva_osnovnie-principi-provedeniya-validacii_2005.pdf (дата обращения 06.04.2023)
2. Йоахим Эрмер, Джон Х. МакБ. Миллер. Валидация методик в фармацевтическом анализе. Примеры наилучших практик, 1-е изд.: Пер. с англ. /– М: Группа компаний ВИАЛЕК, 2013 -512 с.