ПРЕПАРАТ «ГЛУТОКСИМ» В ИНГИБИРОВАНИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА БАКТЕРИЙ

THE PREPARATION "GLUTOXIM" IN INHIBITION OF OXIDATIVE STRESS OF BACTERIA

Ruslan Gurbanov

Student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University. A.A. Kadyrov,

Russia, Grozny

Petimat Dzhambetova

Doctor of Biological Sciences, Professor Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology Chechen State University. A.A. Kadyrov,

Russia, Grozny

АННОТАЦИЯ

Исследование лекарственного препарата глутоксим (иммуностимулятор). Выявлено отсутствие способности индуцировать окислительный стресс в клетках штаммов E.coli MG1655 (pSoxS-lux и pKatG-lux). Отдельные концентрации данного препарата оказывают бактерицидное воздействие на использованные штаммы. При увеличении концентрации глутоксима падает и эффективность антиоксидантного эффекта. Более высокие концентрации вещества препарата, либо не способны оказывать никакого антиоксидативного воздействия, либо же увеличивают исходный уровень люминесценции положительного контроля при совместном воздействие, проявляя себя как оксидант.

ABSTRACT

Study of the drug Glutoxim (an immunostimulant). The absence of the ability to induce oxidative stress in the cells of E. coli MG1655 strains (pSoxS-lux and pKatG-lux) was revealed. Separate concentrations of this drug have a bactericidal effect on the strains used. With an increase in the concentration of glutoxim, the effectiveness of the antioxidant effect also decreases. Higher concentrations of the drug substance are either not able to have any antioxidant effect, or they increase the initial level of luminescence of the positive control when combined, acting as an oxidant.

Ключевые слова: E.coli MG1655 (pSoxS-lux), E.coli MG1655 (pKatG-lux), глутоксим, окислительный стресс, антиоксидант.

Keywords: E.coli MG1655 (pSoxS-lux), E.coli MG1655 (pKatG-lux), glutoxim, oxidative stress, antioxidant.

Введение. Препарат глутоксим относится к синтетическим иммуностимуляторам, активными веществами которого являются аминокислоты: глутамил‑цистеинил‑глицин динатрия. Препарат обладает иммуномодулирующим и иммуностимулирующим действием, лимитирует токсические вещества и способствует сохранению клеточных мембран при их разрушении, стимулирует активность процессов, связанных с кровью, ингибирует лекарственную резистентность опухолей к антибиотикам (блеомицин, доксорубицин, дактиномицин, митомицин и др.). Т.к. глутоксим является иммуномодулятором, то он влияет на кальций-зависимые сигнальные пути макрофагов, активируя различные ферменты лизосом (кислая рибонуклеаза, фосфатаза, фосфолипаза, протеаза и др.), способствует выживаемости тканевых макрофагов и их нормальному функционированию, опосредовано стимулирует поглощение микробов и образование активных форм кислорода (пероксид водорода, гидроксильный радикал), индуцирует образование кровеносных сосудов посредством факторов некроза опухоли. Значительную роль играет в секреции цитокинов: интерлейкины- 1, 2 и 6, интерферонов, эритропоэтина, фактора некроза опухоли, катионных противомикробных пептидов (каталецидинов).

Глутоксим применяют в профилактике и лечения вторичных иммунодефицитов (СПИД, напр.), ассоциированных с радиационными, химическими (цитостатики) и инфекционными факторами (вирусные, бактериальные и паразитарные), для восстановления подавленных иммунных реакций организма и подавленного состояния костномозгового кроветворения; в профилактике и повышения устойчивости организма к инфекционным агентам, химическим и физическим фактором (радиация, например); также в качестве антиоксиданта; для профилактики послеоперационных гнойных осложнений; применяется в комплексной терапии вместе с цитостатиками против злокачественных новообразований;  модулирует внутриклеточный процесс метаболизма тиолов; устраняет или ослабляет неспецифические синдромы болезни [1, 2, 6].

Sokolova G.B с соавторами (2002), исследовали глутоксим на 42 больных туберкулезом с применением традиционных режимов лечения. Результаты рандомизированного исследования у пациентов с тяжелым диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких продемонстрировали высокую эффективность глутоксима и его хорошую переносимость. Применение глутоксима было особенно благоприятным у пациентов с тяжелым туберкулезом, осложненным вирусным гепатитом [3].

Аналогичное исследование проведено Knoring B.E. (2003), который изучал влияние глутоксима, включенного в схему предоперационного препарата, на иммунологические показатели у больных фиброкавернозным туберкулезом легких. После прекращения курса терапии глутоксимом, наблюдалось увеличение исходных низких значений лимфоцитарной пролиферативной активности зрелых Т-лимфоцитов и выработки IL-2, индуцированного фитогемагглютинином. У пациентов, получавших глутоксим, с исходными иммунологическими нарушениями было обнаружено, что прогрессирование происходит в 1,5-2 раза реже, чем в контрольной группе [5].

На данный момент нет ни одного исследования, которое было бы проведено с глутоксимом на люкс-штаммах Escherichia coli, которые являются достаточно точными и простыми в использовании и подходят для оценки окислительного/антиокислительного стресса в бактериальных клетках.

Материалы и методика. Использовали генно-модифицированные штаммы люминесцирующих lux-биосенсоров для регистрации окислительного стресса в клетках. Штаммы созданы путем трансформации Escherichia coli MG1655 гибридными плазмидами pSoxS-lux, pKatG-lux. E.coli MG1655 (pSoxS-lux) применяется для детекции ответа на окислительный стресс, вызванный появлением в среде супероксид-аниона; E.coli MG1655 (pKatG-lux) используется также для детекции ответа на окислительный стресс, но вызванный появлением в среде пероксида водорода [4, 7].

Культуру бактерий E. coli выращивали на среде Луриа-Бертани (LB) с добавлением антибиотика ампициллина (100 мкг/мл). Измерения проводили на денситометре DEN-1 («BioSan», Латвия).

Аликвоты полученной культуры (160 мкл) закапывали в лунки 96-луночного микропланшета и добавляли туда же, в зависимости от исходного варианта эксперимента:

-  отрицательный контроль - 40 мкл дистиллированной (k-);

- положительный контроль - 20 мкл дистиллированной воды и 20 мкл оксиданта (перекись водорода, 10^-3 М) (k+).

Микропланшет с содержимым культивировали при 37°C и снимали показания по истечению определённого промежутка времени: pKatG–lux - 45 мин., pSoxS–lux - 60 мин. Уровень люминесценции измеряли на микропланшетном люминометре Luminometer photometer LM 01A (IMMUNOTECH s.r.o, Czech Republic) и выражали в относительных световых единицах (RLU).

Фактор индукции (R) определяли по формуле: R = I_ind /I₀ , где  I_ind – интенсивность люминесценции исследуемого вещества, I₀ – интенсивность контрольной культуры

Глутоксим (ФГБУ НМИЦ кардиологии Минздрава России, Россия). Концентрации: 3,11×10^-2 М; 1,555×10^-2 М; 7,775×10^-3 М; 3,8875×10^-3 М; 1,9437×10^-3 М; 9,7187×10^-4 М; 4,8593×10^-4 М; 2,4297×10^-4 М; 1,2148×10^-4 М; 6,0742×10^-5 М.

Результаты исследования.

1) Опыты с глутоксимом на штамме E.coli MG1655 (pKatG–lux) (табл. 1):

а) Отдельные концентрации препарата данного исследования, оказали бактерицидный эффект на культуру. Но по мере увеличения концентрации вещества в препарате усиливается оказываемый им бактерицидный эффект до концентрации 7,775×10^-3 М. При этой концентрации отмечается максимальный бактерицидный эффект (R=0,6534), который при дальнейшем увеличении концентрации препарата начинает снижаться. Минимальная концентрация - 6,0742×10^-5 М при сравнении с отрицательным контролем дает люминесцентный эффект в 0,9214 раза слабее. Наиболее концентрированный раствор препарата (3,11×10^-2 М) понижает уровень свечения в 0,7144 раза в сравнение с отрицательным контролем.

Таблица 1.

Степень влияния концентраций глутоксима на генно-модифицированные штаммы E. coli.

б) Совместное воздействие препарата глутоксима с перекисью водорода (оксидант, k+) характеризуется антиоксидантным действием. Самая высокая концентрация препарата (3,11×10^-2 М), оказала самое низкой антиоксидативное действие, в сравнение с положительным контролем свечение понизилось в 0,9731. Пик антиоксидативного влияния пришелся на концентрацию 1,2148×10^-4 М, в 0,8341 раза меньше положительного контроля.

2) Опыты на штамме Е.coli MG1655 (pSoxS–lux) (табл. 1):

а) Все отдельные концентрации препарата оказали бактерицидный эффект, по степени влияния аналогично действию штамма E.coli MG1655 (pKatG–lux). Наименьшая концентрация - 6,0742×10^-5 М, оказала самый низкий бактерицидный эффект, в 0,8623 раза меньше отрицательного контроля. Пик бактерицидного эффекта пришелся на концентрацию 7,775×10^-3 М, в 0,6141 раза меньше отрицательного контроля.

б) Совместное воздействие лекарства глутоксима с перекисью водорода показало похожую тенденцию антиоксидативного действия, как у E.coli MG1655 (pKatG–lux). Максимально концентрированный раствор (3,11×10^-2 М), понизил уровень свечения в 0,9142 раза при сравнении с положительным контролем. Пик ингибирования люминесценции и соответственно антиоксидативного действия пришелся на концентрацию 2,4297×10^-4 М, люминесценция снизилась в 0,717 по сравнению с положительным контролем.

Обсуждение. По итогам экспериментов с глутоксимом было выяснено отсутствие способности индуцировать оксидативный стресс в клетках E.coli. Отдельные концентрации данного препарата оказывают бактерицидное воздействие на использованные штаммы. Концентрация глутоксима в 7,775×10^-3 М для двух данных штаммов бактерий, является самой эффективной в подавление жизнедеятельности микроорганизмов.

Если говорить о совместном действие перекиси водорода (оксиданта) с концентрациями глутоксима, то все они оказывают в той или иной степени антиоксидативное воздействие, но неразбавленная максимальная концентрация препарата - 3,11×10^-2 М, показала самое слабое антиоксидативное воздействие. На основе этого и того, что при увеличении концентрации глутоксима падает и эффективность антиоксидантного эффекта, можно сделать предположение, что более высокие концентрации вещества препарата, либо не способны оказывать никакого антиоксидативного воздействия, либо же увеличить исходный уровень люминесценции положительного контроля при совместном воздействие, проявляя себя в виде оксиданта. Пик антиоксидантного эффекта приходится на самые низкие концентрации (1,2148×10^-4 М - pKatG–lux; 2,4297×10^-4 М – pSoxS-lux), показывая данные в 0,8341 и 0,717 раз меньше положительного контроля.

Выводы.

1. Препарат глутоксим не способен оказывать окислительный стресс в бактериальных клетках;
2. Оказывает антиоксидативный эффект при воздействии перекиси водорода на клетки E.coli, то есть являются антиоксидантами.
3. Глутоксим обладает бактерицидным действием.

Список литературы:

1. Ефременко Е.С. Метаболическая направленность терапевтических воздействий на эффективность антиокислительной защиты при алкогольном абстинентном синдроме. //Журнал здоровье, демография, экология финно-угорских народов. – 2017. – С. 47-49.
2. Можокина Г.Н. Влияние глутоксима на формирование и течение туберкулезного воспаления у экспериментальных животных. /Можокина Г.Н, Елистратова Н.А., Михайлова Л.П., Куничан А.Д. //Журнал цитокины и воспаление. – 2002. – С. 47-51
3. Sokolova GB, Sinitsyn MV, Kozhemiakin LA, Perel'man MI. [Glutoxim in the complex treatment of tuberculosis]. Antibiotiki i Khimioterapiia = Antibiotics and Chemoterapy [sic]. 2002 ;47(2):20-23. PMID: 12087719.
4. Котова В.Ю. Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики. /Котова В.Ю., Рыженкова В.Ю, Манухов И.В, Завильгейский Г.Б. //Прикладная биохимия и микробиология. – 2014. – Т. 50. – № 1. – С. 112–117.
5. Knoring BE, Avetisian AO, El'kin AV, et al. [Immunological changes in patients with pulmonary tuberculosis during glutoxim therapy] Problemy Tuberkuleza i Boleznei Legkikh. 2003 (7):42-47. PMID: 12939879.
6. Sinitsyn MV, Bogadel'nikova IV. [Glutoxim in the surgical treatment of patients with pulmonary tuberculosis] Problemy Tuberkuleza i Boleznei Legkikh. 2007 (5):17-20. PMID: 17598458.
7. Манухов И.В. Индукция окислительного стресса и SOS–ответа в бактериях Escherichia coli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной. / Манухов И.В., Котова В.Ю., Мальдов Д.Г., Ильичев А.В., Бельков А.П., Завильгельский Г.Б. // Микробиология. –  2008. – Т. 77. – № 5. – С. 590–597.