О ВЛИЯНИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА МИКРОБИОТУ

ON THE INFLUENCE OF HEAVY METALS ON MICROBIOTE

Daniil Shoshin

student, Department of Biology and Soil Science, Orenburg State University,

Russia, Orenburg

Elena Sizova

scientific adviser, Dr. Biol. Sciences, Assoc., Orenburg State University,

Russia, Orenburg

АННОТАЦИЯ

В статье приводится обзор основных механизмов воздействия тяжелых металлов на микробиоту, токсических эффектов этого воздействия в зависимости от ряда факторов окружающей среды. Определяется степень устойчивости грибов и бактерий в отношении тяжелых металлов, физиолого-биохимические параметры культуры при контаминации и изменения в биохимических циклах.

ABSTRACT

The article provides an overview of the main mechanisms of the impact of heavy metals on the microbiota, the toxic effects of this impact, depending on a number of environmental factors. The degree of resistance of fungi and bacteria to heavy metals, physiological and biochemical parameters of the culture during contamination and changes in biochemical cycles are determined.

Ключевые слова: бактерии, грибы, тяжелые металлы, ингибирование роста культур микроорганизмов.

Keywords: bacteria, fungi, heavy metals, inhibition of the growth of cultures of microorganisms.

Токсическое действие тяжелых металлов на микроорганизмы обусловлено достаточно легким взаимодействием катионов с различными электрон-донорными группами в составе многих органических соединений, и как следствие, образованием комплексов с группами –OH, –COOH, –PO₄^3-, –NH₂ и –SH группами, что свидетельствует о неспецифичности данного воздействия. Иначе говоря, тяжелые металлы способны реагировать практически со всеми типами веществ, участвующими в метаболизме клеток – белками, нуклеотидами, коферментами, фосфолипидами, порфиринами. Воздействуя на активный центр фермента или замещая в нем отдельные ионы, тяжелые металлы ингибируют соответствующие процессы [1].

Контаминация почв тяжелыми металлами ведет к нарушению функционирования микробиоты, играющей фундаментальную роль в процессах деградации и минерализации органических веществ [2]. Тяжелые металлы влияют на биомассу, разнообразие и активность почвенных микроорганизмов: замедляют скорость роста и размножения, формируя новое сообщество с преобладанием меньшего числа штаммов, устойчивого к воздействию [3].

Биоиндикация загрязненных почв с помощью микроорганизмов наиболее чувствительна и требует меньших временных затрат по сравнению с мониторингом химических и физических свойств, на изменение которых могут потребоваться месяцы и даже годы. Такой подход отражает реальное влияние стрессовых условий на рост и активность почвенной микрофлоры [4].

Токсический эффект воздействия тяжелых металлов на микроорганизмы зависит от следующего ряда факторов: глинистость минералов, температура почвы, pH, наличие органического вещества, неорганических анионов и катионов, а также химических форм металла.

Результаты исследований, описывающих влияние тяжелых металлов на биологические свойства почвы не однозначны: одни зафиксировали отрицательные эффекты [5], другие сообщили об отсутствии связи между высокими концентрациями тяжелых металлов и микробиологическими свойствами почвы [3]. Подобные разногласия могут возникнуть в следствие различий методик проведения эксперимента в лабораторных условиях с использованием искусственно загрязненных почв и почв с территорий, фактически подверженных антропогенному воздействию в полевых условиях. Поэтому в подобных исследованиях не рекомендуется сосредотачиваться исключительно на одном методе, а использовать более широкий их спектр, учитывающих состояние микробной биомассы, минерализацию углерода и азота, процессы дыхания и ферментативную активность, а не сосредотачиваться на одном методе, поскольку результаты, полученные в процессе использования различных методов были бы более всеобъемлющими и убедительными.

Так, в одной из работ [5] была проведена оценка влияния загрязнения почвы тяжелыми металлами на микроорганизмы с использованием различных методов оценки биологической активности и выделены следующие эффективные индикаторы деградации почвы тяжелыми металлами: отношение углерода микробной биомассы к окисляемому углероду, метаболический коэффициент, а также активности дегидрогеназ и арилсульфатаз.

Помимо бактерий, еще одним компонентом почвенной микробиоты являются грибы. Часто утверждается, что грибы более устойчивы к тяжелым металлам, чем бактерии [6, 7]. Первоначально подобные выводы были сделаны при сравнении металлоустойчивости чистых культурных изолятов почвенных микроорганизмов [8]. Аналогичные результаты получены с использованием анализа фосфолипидных жирных кислот (pLFA) для различения грибковых и бактериальных компонентов микробной биомассы почвы [9, 10]. Кроме того, различные измерения биомассы или методы подсчета на чашках также показали, что тяжелые металлы по-разному влияют на бактерии и грибы [11, 12].

О снижении уровня грибкового маркера pLFA в почвах хвойных лесов вблизи металлургических заводов сообщили T. Pennanen с соавторами [13]. Однако, они пришли к выводу, что это, вероятно, не связано с прямым воздействием металлов на грибы. Высокие количества металлов нарушали рост деревьев, и это оказывало влияние на микоризу. Таким образом, для сравнения воздействия тяжелых металлов на сапротрофную часть грибного и бактериального сообществ следует проводить эксперименты без участия растений.

В одном из исследований [14] изучалось влияние Cu и Zn на активность бактерий и грибов, а также на общую микробную активность (почвенное дыхание). Бактериальную активность оценивали с использованием метода включения тимидина на бактерии, извлеченные из почвы [15], с модификациями, внесенными E. Baath [16].  Грибковую активность измеряли с использованием метода ацетата в эргостероле, разработанного S. Y. Newell и R. D. Fallon [17] и модифицированного для использования в почвенной среде обитания E. Baath [18].

На скорость дыхания почвы незначительно повлияло загрязнение металлами, хотя отчетливый эффект «доза-реакция» наблюдался при концентрациях добавленных металлов выше 4 ммоль/кг. Самый высокий уровень Cu и Zn привел к снижению скорости дыхания почвы на 30 % по сравнению с контрольной почвой. Влияние металлов на скорость дыхания почвы при загрязнении цинком и медью не различается.

Бактериальная активность, измеренная как скорость включения тимидина, линейно снижалась с логарифмом добавления металла выше концентрации 2 ммоль/кг. Различий между эффектами из-за загрязнения цинком и медью не наблюдалось. Самый высокий уровень металлов снизил активность бактерий до менее чем 10 % от таковой в контрольных образцах. Пятидесятипроцентная эффективная доза (экологическая доза, приводящая к снижению активности на 50 %) составляла около 10 ммоль добавленного металла на 1 кг.

Грибковая активность, измеряемая по включению ацетата в эргостерол, увеличивалась при концентрации добавленного в почву металла выше 4 ммоль/кг. Увеличение было наиболее очевидным для почвы, загрязненной Cu, где самый высокий уровень добавления Cu увеличивал активность грибов в семь раз. В загрязненной цинком почве активность грибов была в три раза выше, чем в контрольных образцах.

Микробная биомасса, оцененная с помощью SIR, лишь незначительно снизилась в почвах, загрязненных металлами в концентрациях выше 8 ммоль/кг. Количество бактериальных пластинок резко снизилось в двух наиболее загрязненных образцах (64 и 128 ммоль/кг), составив менее 0,2 % от контрольной почвы по загрязнению как Cu, так и Zn. Добавление металлов не оказало значительного влияния на подсчет грибковых пластинок.

Что касается грибов, то тяжелые металлы влияют на них по-разному, либо угнетая, либо стимулируя, например, стронций в некоторых видах почв резко повышает токсинообразование и рост грибов рода Fusarium. Наиболее токсичным в отношении почвенной микробиоты является кадмий, наименее – свинец.

Микромицеты в районах регулярных промышленных выбросов способны накапливать медь и никель в количестве 0,3 - 1,5 % сухой биомассы, что свидетельствует в пользу их использования как видов-биоиндикаторов.

При контаминации почв тяжелыми металлами, аналогично бактериям, в грибковых сообществах начинают преобладать наиболее устойчивые виды и исключаются не толерантные.

Токсические эффекты воздействия металлов на микроскопические грибы достаточно многообразны. Медь, кобальт и молибден, например, нарушают морфогенез грибов рода Fusarium; ионы Сu и Zn в концентрации более 50 и 100 мкг/мл соответственно убивают виды рода Penicillium. Ионы кадмия полностью, а меди частично подавляют транспорт цинка в мицелии Penicillum notatum. Цинк с концентрацией около 10 мг/кг – эссенциальный элемент для синтеза афлатоксинов Aspergillus parasiticus и Aspergillus flavus.

Тяжелые металлы, в частности, медь и цинк, оказывают влияние и на генетический аппарат клеток гриба, и как следствие, на синтез белка и организацию клеточной мембраны, усиливая образование микотоксинов.

Отмечено, что высокие концентрации меди резко подавляют развитие сапрофитных грибов, усиливают фитотоксические свойства у Penicillium nigricans, Penicillium lanosum, Trichoderma koningii.

При исследовании вторичных метаболитов грибов рода Penicillium, выделенных из загрязненных почв, установлено наличие среди них опаснейших микотоксинов – α-циклопиазоновой кислоты, клавиновых эргоалкалоидов. Меняется структура биоценоза, например, у сапрофитных грибов рода Fusarium возрастает приспособление к паразитическому образу жизни.

Ингибирование роста культур микроорганизмов.

Ингибирующее влияние тяжелых металлов на рост и жизнеспособность микроорганизмов наблюдается в следующих диапазонах концентраций: Hg, органортутные соединения и Ag – 10^-6 – 10^-8 М; Cd, Co, Cu, Pb, Ni и Zn для бактерий – 10^-6 – 10^-4 М (исключение составляют цианобактерии – 10^-7 – 10^-6 М и тионовые бактерии – 10^-3 – 10^-2 М); для водорослей этот диапазон в основном равен 10^-7 – 10^-6 М; для грибов 10^-3 – 10^-2 М. Иными словами, наиболее устойчивы к воздействию металлов грибы и тионовые бактерии. Грамположительные виды бактерий более чувствительны к действию ртути и кадмия, чем грамотрицательные.

Самыми токсичными для микроорганизмов являются Hg и Ag, за ними следуют Cu, Cd, Pb, Co, Ni, Cr, Zn, Mn, Fe и так далее. Тяжелые металлы могут вызывать длительную задержку роста с последующим восстановлением его скорости и общей биомассы, или же без увелечения длительности lag-фазы подавлять рост и деление бактерий. Установлено, что иногда низкие концентрации металла стимулируют активность метаболических процессов, а более высокие становятся токсичными. Поэтому важным в практическом отношении является вопрос о возможных и критических концентрациях тяжелых металлов, который должен решаться для каждого вида микроорганизма и металла отдельно.

Физиолого-биохимические параметры микроорганизмов при действии металлов.

При культивировании микроорганизмов в присутствии высоких концентраций металлов могут происходить такие изменения в морфологии клеток, как увеличение размера (общий показатель для ряда неблагоприятных факторов) и образование неспецифических форм, например, нитевидных E. coli. Подобные нарушения связаны в первую очередь с разобщением процессов роста и деления клеток. В клетках формируются различные включения, дополнительные глобулы липидов, митохондрии неправильной формы, уменьшается число рибосом и так далее. У фотосинтезирующих микроорганизмов под действием тяжелых металлов снижается содержание хлорофилла в клетках. Нарушение функций цитоплазматической мембраны влечет за собой потерю клетками аминокислот, нуклеотидов, ингибирование транспорта веществ и так далее.

Влияние тяжелых металлов на энергетические и биосинтетические процессы.

Отличительным эффектом воздействия всех категорий тяжелых металлов на микроорганизмы является подавление у последних процессов дыхания. Особенно отчетливо это наблюдается при концентрациях металлов (10^-4 – 10^-3М) более высоких, чем те, которые ингибируют рост. Явление это обусловлено ингибированием транспорта субстратов в клетку и нарушением работы компонентов дыхательной цепи. Под действием тяжелых металлов может происходить также ингибирование брожения, подавляться фотосинтез и азотофиксация.

Тяжелые металлы подавляют биосинтез, вызывая изменения в содержании основных полимеров в клетках., особенно белков и рибонуклеиновых кислот. Не исключен и мутагенный эффект, связанный с увеличением частоты мутаций, хромосомных аберраций или других нарушений ДНК.

Иными словами, тяжелые металлы комплексно воздействуют на многие участки метаболических путей у бактерий и грибов.

Недавние исследования в различных экосистемах показали, что грибы и бактерии могут иметь антагонистические отношения: то есть увеличение активности одной группы организмов приводит к снижению активности другой. Об этом явлении сообщалось в исследовании разложения опада водных растений [19] и в другом исследовании разложения листьев бука в почве [20]. Это первое исследование, в котором изучалось прямое влияние металлов на скорость роста грибков и бактерий в почве.

Механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам.

Чтобы обезопасить себя от негативного воздействия, клетка может выработать систему металлорезистентности, степень устойчивости которой определяется типом и количеством механизмов поглощения металлов; ролью, которую каждый металл играет в нормальном метаболизме, и наличием генов, локализованных в плазмидах, хромосомах или транспозонах, которые контролируют резистентность к металлам. При этом чаще всего выделяют шесть механизмов: элиминация металлов барьером проницаемости; активный транспорт металла из клетки; внутриклеточное секвестрирование металла, отграничение от метаболического пула путем связывания с белками; внеклеточное секвестрирование; ферментативная детоксикация металла до менее токсичной формы; уменьшение чувствительности клеточных мишеней.

Многие микроорганизмы, по-видимому, в той или иной степени способны противостоять токсическому действию тяжелых металлов, причем устойчивость микробных культур, исходно чувствительных, можно развивать путем многократных пересевов в присутствии возрастающих концентраций металла. «Приспособление» – также один из механизмов резистентности. Гены, кодирующие признак устойчивости к тяжелым металлам, могут передаваться из клетки в клетку с помощью R-плазмид, пенициллиновых плазмид, и транспозонов [1].

Биохимические механизмы адаптации связаны со снижением аккумуляции тяжелых металлов за счет конкуренции и обмена их с протонами на поверхности клеток, выходом калия и магния, а также с возможностью энергозависимого выброса токсиканта. Обезвреживание тяжелых металлов происходит в результате их связывания, хелатирования, осаждения и трансформации в мало-токсические формы, деметилированием или образованием металлорганических соединений.

Список литературы:

1. Багаева, Т. В. Микробиологическая ремедиация природных систем от тяжелых металлов / Т. В. Багаева, Н. Э. Ионова, Г. В. Надеева. – Казань : Казанский университет, 2013. – 56 с.
2. Castaldi, S. Suitability of soil microbial parameters as indicators of heavy metal pollution / S. Castaldi, F. A. Rutigliano, A. Virzo de Santo // Water, Air, & Soil Pollution. – 2004. – V 158. – № 1. – P. 21-35.
3. Simon, T. The effect of increasing rates of nickel and arsenic on the growth of radish and soil microflora / T. Simon // Rostlinna vyroba. – 1999. – № 45. – P. 421-430.
4. Measurement in assessing the risk of chemicals to the soil ecosystem / P. Nannipieri, L. Badalucco, L. Landi, G. Pietramellara // Ecotoxicology: Responses, Biomarkers and Risk Assessment. – 1997. – № 1. – P. 507-534.
5. Friedlova, M. The influence of heavy metals on soil biological and chemical properties / M. Friedlova // Soil and Water Research. – 2010. – V 5. – № 1. – P. 21‑27.
6. Doelman, P. Resistance of soil microbial communities to heavy metals / P. Doelman // Microbial communities in soil. – 1985. – № 4. – P. 369-384.
7. Hiroki, M. Effects of heavy metal contamination on soil microbial populations / M. Hiroki // Soil Science Plant Nutrient. – 1992. – № 38. – P. 141-147.
8. Babich, H. Toxicity of zinc to fungi, bacteria, and coliphages: influence of chloride ions / H. Babich, G. Stotzky // Appliance Environmental Microbiology. – 1978. – № 36. – P. 906-914.
9. Kelly, J. J. Changes in soil microbial communities over time resulting from one time application of zinc: a laboratory microcosm study / J. J. Kelly, M. Haggblom, R. L. Tate // Soil Biology Biochemistry. – 1999. – № 31. – P. 1455‑1465.
10. Duffus, J. H. Heavy metals – A meaningless term? / J. H. Duffus // Pure and Applied Chemistry. – 2002. – № 74(5). – P. 793-807.
11. Khan, M. Effects of metal (Cd, Cu, Ni, Pb or Zn) enrichment of sewage-sludge on soil microorganisms and their acitivities / M. Khan, J. Scullion // Appliance Soil Ecology. – 2002. – № 20. – P. 145-155.
12. The effect of long-term mercury pollution on the soil microbial community / A. K. Muller, K. Westergaard, S. Christensen, S. J. Sorensen // FEMS Microbiological Ecology. – 2001. – № 36. – P. 11-19.
13. Pennanen, T. Phospholipid fatty acid composition and heavy metal tolerance of soil microbial communities along two heavy metal-polluted gradients in coniferous forests / T. Pennanen, A. Frostegaard, H. Fritze // Appliance Environmental Microbiology. – 1996. – № 62. – P. 420-428.
14. Rajapaksha, Metal Toxicity Affects Fungal and Bacterial Activities in Soil Differently / R. M.  R. M. Rajapaksha, M. A Tobor-Kaplon, E. Baath // Applied and environmental microbiology. – 2004. – № 5. – P. 2966-2973.
15. Baath, E. Thymidine incorporation into macromolecules of bacteria extracted from soil by homogenization-centrifugation / E. Baath // Soil Biology Biochemistry. – 1992. – № 24. – P.1157-1165.
16. Baath, E. Adaptation of a rapid and economical microcentrifugation method to measure thymidine and leucine incorporation by soil bacteria // E. Baath, M. Pettersson, K. H. Soderberg // Soil Biology Biochemistry. – 2001. – № 33. – P. 1571-1574.
17. Newell, S. Y. Towards a method for measuring instantaneous fungal growth rates in field samples / S. Y. Newell, R. D. Fallon // Ecology. – 1991. – № 72. – P. 1547-1559.
18. Baath, E. Estimation of fungal growth rates in soil using 14C-acetate incorporation into ergosterol / E.  Baath // Soil Biology Biochemistry. – 2001. – № 33. – P. 2011-2018.
19. Mille-Lindblom, C. Antagonism between bacteria and fungi on decomposing aquatic plant litter / C. Mille-Lindblom, L. J. Tranvik // Microbiological Ecology. – 2003. – № 45. – P. 173-182.
20. Moller, J. Fungal-bacterial interaction on beech leaves: influence on decomposition and dissolved organic carbon quality / J. Moller, M. Miller, A. Kjoller // Soil Biology Biochemistry. – 1999. – № 31. – P. 367-374.