АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ У ЖЕНЩИН С РАКОМ ЯИЧНИКА В ЧЕЧЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

ANALYSIS OF POLYMORPHIC VARIANTS OF REPAIR GENES IN WOMEN WITH OVARIAN CANCER IN THE CHECHEN POPULATION

Elima Makhauri Elima

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

Madina Machukaeva

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

Laila Dodnaeva

Master's student, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

Petimat Dzhambetova

scientific adviser, Professor, Department of Cell Biology, Morphology and Microbiology, Chechen State University,

Russia, Grozny

АННОТАЦИЯ

Изучена роль полиморфизма генов XRCC3 (rs861539), XRCC2 (rs718282, rs3218536), входящих в систему репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации двухцепочечных разрывов ДНК [Jackson SP. 2002]. Исследование продемонстрировало значительную связь изученного полиморфизма 41657C/T гена XRCC2 и Thr241Met гена XRCC3 с риском развития рака яичников. В то же время полиморфизм Arg188His XRCC2 не обнаружил ассоциацию с раком яичников. Таким образом, результаты исследования показывают, что сбой в системе репарации ДНК, в частности путем гомологичной рекомбинации, влияет на риск развития рака яичников в популяционной группе женщин ЧР.

ABSTRACT

Studied the role of polymorphism of genes XRCC3 (rs861539), XRCC2 (rs718282, rs3218536), included in the DNA repair system through homologous recombination of double-stranded DNA breaks [Jackson SP. 2002]. The study demonstrated a significant relationship between the studied polymorphism 41657C/T of the XRCC2 gene and Thr241Met of the XRCC3 gene with the risk of ovarian cancer. At the same time, the Arg188His XRCC2 polymorphism was not associated with ovarian cancer. Thus, the results of the study show that a failure in the DNA repair system, in particular through homologous recombination, affects the risk of developing ovarian cancer in the population group of women in the CR.

Ключевые слова. XRCC3, XRCC2, rs861539, rs718282, rs3218536, рак яичников, чеченская популяция.

Keywords. XRCC3, XRCC2, rs861539, rs718282, rs3218536, ovarian cancer, Chechen population.

Репарация ДНК – это особая функция клеток, заключающаяся в устранении дефектов в молекулах нуклеиновых кислот, структура которых нарушается как спонтанно в ходе репликации в клетке, так и под воздействием физических или химических реагентов. Установлено, что сниженная способность к репарации ДНК, является основной причиной раковых заболеваний [2]. На процесс репарации ДНК может влиять полиморфизм генов репарации, детерминирующие дефекты соответствующих белков, обуславливающих, в свою очередь, индивидуальную предрасположенность к формированию неопластических заболеваний [9]. Было идентифицировано более 130 генов репарации ДНК, в которых была обнаружена серия однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [15]. Показано, что изменчивость, обнаруживаемая в генах репарации ДНК, может иметь клиническое значение для оценки риска возникновения определенного типа рака, его профилактики и лечения [8].

Мы изучили взаимосвязь между полиморфизмом генов репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации и предрасположенностью к злокачественным новообразованиям в яичниках в однородной популяции Чеченской республики. На сегодняшний день единая модель прогнозирования генетического риска РЯ отсутствует. В связи с этим актуальным является оценка возможности расширения диапазона молекулярных маркеров, позволяющих более эффективно прогнозировать образование рака яичников.

На роль молекулярных маркеров нами были отобраны следующие гены: XRCC3 (rs861539), XRCC2 (rs718282, rs3218536) полиморфизмы которых, по данным исследований, были связаны с различными типами неопластических заболеваний.

Материал и методы исследования. Образцы венозной крови были получены от пациентов с раком яичников (n  = 60), находившихся на стационарном лечении и проходивших обследование в отделениях ГБУ "Республиканский Онкологический Диспансер" г. Грозный в 2016–2020 годах. Исследуемая группа пациентов была этнически однородной, относилась к чеченской популяции. Каждый пациент дал письменное информированное согласие. Для сравнения была сформирована группа контроля из 135 здоровых женщин. Средний возраст пациенток с РЯ составил 61,8 ±5 лет.

Определение однонуклеотидных полиморфизмов в генах репарации ДНК проводили методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ). Для идентификации полиморфизмов использовали последовательности из открытых источников.

Для ПЦР использовали наборы GenPak Real-Time PCR core (Isogene Lab.Ltd, Москва). Амплификацию проводили в Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (США) в адаптированных условиях. (Таблицу 2).

Таблица 2.

Условия термоциклера для ПЦР и длины фрагментов для полиморфных вариантов исследуемых генов репарации ДНК

Для выявления аллелей генов амплификаты инкубировали с соответствующими эндонуклеазами в течение 16 ч (табл. 3). Для анализа полученных рестриктов проводили горизонтальный электрофорез в 2% агарозном геле с добавленным красителем бромидом этидия.

Для оценки соответствия выборки равновесию Харди-Вайнберга использовали точный тест Фишера. Статистически значимыми различия в частоте полиморфных вариантов и соответствующих им генотипов признавались при p ≤ 0.05. Критерием, определяющим наличие связи аллельного варианта с риском РЯ, считали отношение шансов (ОШ) с его доверительным интервалом (ДИ) при уровне значимости 95%. Результаты с p <0,05 считались значимыми.

Результаты исследования. Проведенный анализ результатов молекулярно-генетического тестирования полиморфизма Thr241Met гена XRCC3 выявил в исследуемых выборках замену 241Met с частотой 50,3% в выборке пациентов и 56,1% в здоровой группе (таблица 3). Чаще всего у пациентов полиморфный вариант 241Met обнаруживался в гетерозиготе (51,7%). В группе здоровых женщин полиморфизм 241Met выявлялся чаще по сравнению с группой больных: 51,5 % против 49,2%. Интересно, что для пациентов наиболее характерным вариантом было гетерозиготное носительство минорного аллеля в отличие от контрольной группы: 48,3% против 32,3%. Для здоровых женщин наиболее характерен гомозиготный вариант генотипа Met/Met. Его частота составила в контроле 35,3%, тогда как у пациенток его частота составила 25,0%. Ассоциативный анализ показал, что гомозигота Met/Met статистически достоверно снижает риск развития рака (ОШ 0,50; 95% ДИ 0,26–0,99, p = 0,043).

Таблица 3.

Распределение генотипа Thr241Met гена XRCC3 у пациентов и контрольной группы

Нами была проанализирована последовательность гена XRCC2 на наличие замен 501A/G и 41657C/Т. Анализ показал, что обе замены в гене XRCC2 широко представлены в обеих выборках (таблица 4 и 5).

Поиск ассоциаций между частотой аллелей и генотипов полиморфного варианта Arg188His гена XRCC2 в изучаемых группах не обнаружил статистически значимых различий в частоте генотипов полиморфизма XRCC2 Arg188His между контрольной группой и пациентами с раком яичников (табл. 4).  Вместе с тем, корреляционный анализ между частотой аллеля T полиморфизма 41657C/Т в группе больных РЯ и частотой этого аллеля в группе здоровых лиц показал, что аллель T достоверно связан со злокачественными новообразованиями яичника. Отношение шансов составило 1,67 при 95% доверительном интервале 1,42–1,96, p <0,0001.

Таблица 4.

Распределение генотипа Arg188His гена XRCC2 у пациенток и контрольной группы

Таблица 5.

Распределение генотипа 41657C/Т гена XRCC2 у пациенток и контрольной группы

Высокий риск развития рака яичника подтвердился у лиц с гомозиготным генотипом T/T: ОШ для носителей генотипа T/T составило 2,00 при 95% ДИ 1,50–2,66 (p < 0,0001).

Обсуждение. Рак яичников - один из наиболее распространенных видов рака у женщин, занимающий третье место после рака шейки матки и матки. Он отличается наихудшим прогнозом и самым высоким уровнем смертности, связанный в основном с бессимптомным ростом опухоли [7]. По оценке GLOBOCAN к 2040 году ожидается значительный рост этого заболевания [1]. Ключевым фактором риска рака яичников является семейный анамнез рака груди или яичников [11], свидетельствующих о роли генетических факторов в риске развития опухоли яичников. Установлено, что более одной пятой случаев РЯ обусловлены мутациями в генах-супрессорах опухолей, а 65–85% наследственных форм рака яичников являются результатом герминальных мутаций в генах BRCA [12].

Предрасположенность к развитию опухоли во многом может определяться индивидуальными способностями к репарации повреждений ДНК. Ошибочная репарация может приводить к потере некоторых хромосом и транслокации, что, в свою очередь, может инициировать процесс развития опухоли [4]. В связи с этим в настоящем исследовании были сделан сравнительный анализ частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов, кодирующих белки, участвующих в репарации путем гомологичной рекомбинации, у женщин с установленным диагнозом РЯ и здоровых лиц. Оценке подверглись наиболее распространенные полиморфизмы генов XRCC2 (Arg188His и 41657C/T) и XRCC3 (Thr241Met), входящих в систему репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации, которая устраняет ряд серьезных дефектов ДНК, в том числе двухцепочечные разрывы [3].

Клетки, дефектные по генам XRCC2 и XRCC3, демонстрируют особую чувствительность к ионизирующему излучению, УФ-излучению и к факторам, которые вызывают образование перекрестных связей [13].

По данным современных исследований полиморфизмы данных генов могут повышать риск возникновения различных новообразований, в том числе рака поджелудочной железы, груди, головы и шеи [6]. В ряде отчетов также было продемонстрировано, что полиморфизм 41657C/T гена XRCC2 играет важную роль в развитии неопластических заболеваний, включая рак яичников [14].

Замена Thr241Met является наиболее тщательно проанализированным полиморфизмом в гене XRCC3 (c. 722C/T; rs861539). Ряд исследований показали влияния полиморфизма на образование рака трижды негативного рака груди, в то время как других исследователи не обнаружили его участия в генезе РМЖ [10]. Польские исследователи пришли к выводу, что никакой корреляции между полиморфизмами генов XRCC2 и XRCC3 и факторами риска рака яичников не наблюдается [5]. Представленное исследование продемонстрировало значительную связь изученного полиморфизмов гена XRCC2 41657C/T и Thr241Met гена XRCC3 с возникновением рака яичников. В то время как полиморфизм Arg188His XRCC2 не обнаружил ассоциацию с раком яичников.

Таким образом, результаты исследования показывают, что сбой в системе репарации ДНК, в частности путем гомологичной рекомбинации, влияют на риск развития рака яичников в популяционной группе женщин ЧР.

Необходимо отметить, что исследование проводилось на этнически однородной популяции, что может помочь понять, в какой степени связь генотипа с фенотипом зависит от популяционной принадлежности.

Список литературы:

1. Bray F. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. /F.Bray, J.Ferlay, I. Soerjomataram, R.L.Siegel, L.A.Torre, A. Jemal. //Cancer J Clin. – 2018, №68(6). – Р.394-424.
2. Hakem R. DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly. / R.Hakem //EMBO J. 2008. №27. – Р.589–605.
3. Jackson SP. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. / S.P.Jackson //Carcinogenesis. -2002. №23. – Р.687–696.
4. Li X. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. / X. Li, W.D Heyer. //Cell Res. -  2008. №18. – Р.99–113.
5. Michalska M.M. Association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of XRCC2 and XRCC3 homologous recombination repair genes and ovarian cancer in Polish women. /Magdalena M. M., Dariusz Samulak, Hanna Romanowicz, Filip Jabłoński, Beata Smolarz //Experimental and Molecular Pathology. -  2016. Vol.100 № 2, – Р.243-247
6. Michalska M.M. Association of polymorphisms in the 5′ untranslated region of RAD51 gene with risk of endometrial cancer in the Polish population. /M.M.Michalska, D. Samulak, H. Romanowicz, B. Smolarz. //Archives of Gynecology and Obstetrics. -  2014. №5. – Р.985-991.
7. Momenimovahed Z. et al. Ovarian cancer in the world: epidemiology and risk factors. / Z. Momenimovahed, et al. //International journal of women's health. – 2019. №11. – Р.287-299.
8. Romero-Laorden N. Inherited mutations in DNA repair genes and cancer risk. / N. Romero-Laorden, E.Castro //Curr Probl Cancer. – 2017. №41(4) . – Р.251-264.
9. Slyskova J. Collins AR. Both genetic and dietary factors underlie individual differences in DNA damage levels and DNA repair capacity. / J. Slyskova, Y. Lorenzo, A. Karlsen, M.H. Carlsen, V.Novosadova, R. Blomhoff, P. Vodicka, A.R.Collins //DNA Repair (Amst). – 2014. №16. – Р.66–73.
10. Smolarz B. Association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of XRCC2 and XRCC3 homologous recombination repair genes and triple-negative breast cancer in Polish women. / B.Smolarz, M.Makowska, D.Samulak et al. //Clin Exp Med. – 2015. №15. – Р.151–157.
11. Torre LA Ovarian cancer statistics. /Torre LA, Trabert B, DeSantis CE, Miller KD, Samimi G, Runowicz CD, Gaudet MM, Jemal A, Siegel RL //CA Cancer J Clin. – 2018. №68(4) . – Р.284-296.
12. Toss A.L. Hereditary ovarian Cancer: not only BRCA 1 and 2 genes. / A.Toss, C.Tomasello, E.Razzaboni, G.Contu, G.Grandi, A.Cagnacci, R.J.Schilder, L.Cortesi  //Biomed Res Int. - 2015. – Р.341-345.
13. Trzeciak A. DNA repair in mammalian cells: mechanisms of homologous recombination. /A.Trzeciak, J.Błasiak. //Postepy Biochem. - 2001. №47. – Р.38–51
14. Wang N. The association of XRCC2 gene polymorphism with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma and gastric cardiac adenocarcinoma in China. / N. Wang, X.J. Dong, Y.Li, W.Guo, R.M.Zhou, X.J.Zhang, S.J.Wang. //Chuan Xue Za Zhi. -  2007. №24. – Р.538–543.
15. Wood R.D. Human DNA repair genes. /R.D.Wood, M.Mitchell, J.Sgouros, T.Lindahl //Science. - 2001. №291. – Р.1284–1289.