ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА ЦЕФТРИАКСОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ

STUDY OF THE GENOTOXICITY OF THE DRUG CEFTRIAXONE USING LUMINESCENT BACTERIA

Ruslan Gurbanov

student, Chechen State University,

Russia, Grozny

Laila Dodnaeva

Master's student, Chechen State University

Russia, Grozny

Petimat Dzhambetova

Scientific director, Doctor of Biological Sciences, Professor, Chechen State University,

Russia, Grozny

АННОТАЦИЯ

Проведено исследование генотоксичности лекарственного препарата цефтриаксон, относящегося к цефалоспориновому ряду антибиотиков широкого спектра действия с использованием штаммов люминесцентных бактерий E.coli MG1655 (pColD-lux) и E.coli MG1655 (pKatG-lux). Показано отсутствие генотоксичности изученного препарата и сильное бактерицидное воздействие.

ABSTRACT

A study of the genotoxicity of the medicinal product ceftriaxone, which belongs to the cephalosporin series of broad-spectrum antibiotics, was carried out using strains of luminescent bacteria E. coli MG1655 (pColD-lux) and E. coli MG1655 (pKatG-lux). Shown the absence of genotoxicity of the studied drug.

Ключевые слова: цефтриаксон, генотоксичность, люминесценция, E.coli MG1655 (pColD-lux), E.coli MG1655 (pKatG-lux)

Keywords: ceftriaxone, genotoxicity, luminescence, E. coli MG1655 (pColD-lux), E. coli MG1655 (pKatG-lux).

Введение. На сегодняшний день, при тестировании химических веществ, вызывающих мутагенез и канцерогенез, используют lux-биосенсоры в двух вариантах: 1) на подавление биолюминесценции генотоксичным веществом, и на 2) повышении индукции биолюминесценции генотоксичным веществом. При первом варианте, подавление биолюминесценции генотоксичными веществами основано на метаболических процессах клетки, главным образом на дыхательной цепи, влияя на люциферазную реакцию, подавляя интенсивность биолюминесценции клеток. Во втором случае, происходит индукция биолюминесцентных клеток в присутствие генотоксического вещества. Подобные штаммы широко используются для выявления генотоксичности лекарственных препаратов (антибиотики и др.) [2, 4], различных генотоксичных и токсичных веществ [3, 5], для обнаружения тяжелых металлов в компонентах окружающей седы [1].

В данной работе был применен второй метод, основанный на использовании искусственно созданных штаммов люминесцирующих бактерий Escherichia coli MG1655, содержащих гибридные плазмиды pColD-lux и pKatG (табл. 1). Гибридная плазмида содержит гены luxAB (из морских бактерий Vibrio flscheri, Vibrio harveyi, Photobacterium leiognathi и наземных бактерий Photorhabdus luminescens), кодирующие α и β субъединицы люциферазы, которые встраивают в векторную плазмиду под индуцируемый промотор, активирующийся при появлении в среде определенных химических веществ [2].

Цефтриаксон относится к полусинтетическим цефалоспориновым антибиотикам 3-го поколения широкого спектра действия. Активность данного антибиотика обусловлена его бактерицидным действием, проявляющим в виде подавление синтеза клеточных мембран. Цефтриаксон активен в отношении грамотрицательных аэробных микроорганизмов, в том числе и Eschericia coli.

Используется при инфекционных заболеваниях: бактериальных и менингококковых менингитах, боррелиозе Лайма, гонорее, в качестве профилактики послеоперационных инфекций и др. Обычная доза составляет для взрослых составляет 1г/10 мл [1].

В связи с вышесказанным, нами было проведено исследование генотоксичности лекарственного препарата цефтриаксон с использованием люминесцентных штаммов Escherichia coli MG1655, содержащих гибридные плазмиды pColD-lux и pKatG.

Методы исследования. Бактериальные культуры штаммов lux-биосенсоров (табл. 1) выращивали на жидкой среде LB(Луриа-Бертани) до экспоненциальной фазы роста, в течение 10-17 ч. (ночная культура, 5 мл среды) при температуре 37,7 С. По окончанию культивирования ночную культуру измеряли на денситометре DEN-1 («BioSan»), оптимальное значение плотности составляет 4.0-5.0 единиц МакФарланда. Далее 2 мл из ночной культуры добавляли в 20 мл жидкой питательной среды и аэрировали 2 ч. на качалке при температуре 37,7 С. В колбу и пробирку также добавляется ампициллин в соотношение 1/1000 мкл среды. Данные штаммы резистентны к этому антибиотику.

Таблица 1.

Люминесцирующие бактериальные штаммы с видовым названием, а также областью их применения

Затем из колбы культуру вносили дозатором по 180 мкл в лунки 96-ти лунного планшета. Туда же добавляли 20 мкл положительного контроля и отрицательного, а также исследуемый препарат в разных концентрациях. Планшет ставили в термостат и культивировали в зависимости от времени реакции выбранного штамма (табл. 3). В качестве положительного контроля (индуктора) использовал: для E.coli MG1655 (pColD-lux) –диоксидин, вызывающий SOS-ответ; для E.coli MG1655 (pKat-lux) – перекись водорода, который вызывает окислительный стресс. Данные концентраций, веществ и штаммов для них, приведены в табл. 2.

Таблица 2.

Вещества, использованные в качестве положительных контролей

В качестве отрицательного контроля использовалась обычная дистиллированная вода.

Характеристику индукции биолюминесценции измеряли на микропланшетном люминометре Luminometer photometer LM 01A, после окончания культивирования (таблиц 3).

Таблица 3.

Время культивирования бактерий в планшете

Определение уровня индукции биолюминесценции lux-биосенсоров с индуцируемыми промоторами проводили вычислением фактора индукции. Фактор индукции (R) определяется как отношение интенсивности люминесценции культуры lux-биосенсора, содержащей исследуемый препарат (l_ind), к интенсивности люминесценции контрольной культуры lux-биосенсора (l₀): R = l_ind / l_0,  где I₀ - уровень спонтанной люминесценции культуры, I_ind - уровень индуцированной люминесценции культуры.

Результаты исследования. У изучаемых штаммов люминесцентных бактерий различают несколько видов регуляторных систем, специфически реагирующих на токсичные вещества. Это могут быть системы, которые отвечают на повреждение белков, хромосом и мембраны клетки. В роли биосенсора могут, например, на ДНК-повреждающие агенты (митомицин С, УФ-излучение и т.д.) может быть использован любой из S0S-промоторов – PcolD, PrecD. Для определения и оценки генотоксикантов вызывающих в клетке окислительный стресс, используют промоторы PsoxS, PkatG. В нашем исследование рассматривается лишь два штамма E.coli MG1655 (pColD-lux)  и E.coli MG1655 (pKat-lux)  (табл. 1) [2].

Было изучено 4 концентрации цефтриаксона и проверены на 2-х штаммах бактерий на способность вызывать окислительный стресс и SOS-ответ, индуцированный повреждением ДНК в клетках E.coli. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Биолюминесцентный отклик штаммов lux-биосенсоров на присутствие антибиотика цефтриаксона

Примечание: R – фактор индукции. С_Mmin – мин. молярная концентрация, вызывающая достоверное повышение уровня люминесценции; С_Mmax - молярная концентрация цитостатика, при которой наблюдается макс-й уровень люминесценции; «-» - исследуемое вещество не индуцирует люминесценцию.

Рисунок 1. Биолюминесцентный отклик штамма E.coli MG1655 (pKatG-lux) на действие цефтриаксона

Рисунок 2. Биолюминесцентный отлик штамма E.coli MG1655 (pColD-lux) на действие цефтриаксона

В результате проведенного исследования (табл. 4, рис. 1, рис. 2), не было обнаружено повышения уровня биолюминесценции у биосенсоров при взаимодействии с данными концентрациями лекарственного препарата цефтриаксон: 0,087 М, 0,17 М, 0,34 М, 0,69 М.

В результате проведенного исследования, было показано, что антибиотик цефтриаксон не вызывал биолюминесценцию ни в одном из выбранных двух штаммов lux-биосенсоров E.coli. Таким образом, можно предположить, что цефтриаксон не оказывает генотоксического действия на клетки E.coli, вызванные повреждением ДНК и появлением в среде перекиси водорода или свободных форм кислорода. Но было показано, что цефтриаксон проявляет бактерицидные свойства на данных штаммах E.coli подавляя при этом индукцию люминесценции ниже уровня отрицательного контроля в 2 раза у штамма E.coli MG1655 (pKatG-lux), а у E.coli MG1655 (pColD-lux) в 5-6 раз. Такое понижение уровня свечения может свидетельствовать о подавление жизнедеятельности данных бактерий при концентрации от 0,087 М до 0,69 М (рис. 1, рис. 2).

Таким образом, лекарственный препарат цефтриаксон не оказывает генотоксичного воздействия на молекулы ДНК, однако обладает сильным бактерицидным действием.

Список литературы:

1. Завильгельский Г.Б., Котова В.Ю., Хрульнова C.A., Манухов И.В. Оценка токсического действия наноматериалов на живые организмы // Биотехнология - 2013. - № 6. - С. 8-17.
2. Котова В.Ю., Рыженкова K.B., Манухов И.В. 3aвигельский Г.Б. Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики //Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50.— № 1. - С. 112-117. - doi: 10.7868/S0555109914010073.
3. Сазыкина М.А., Чистяков В.А. Мониторинг генотоксичности водной среды: Азово-Донской бассейн: Монография. — Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ, 2009.
4. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Акиньшина Л.П., и др. Исследование генетических эффектов лекарственных веществ и других биологически активных соединений в тестах на мутагенез и ДНК-повреждающее действие//Химико-фармацевтический журнал. —1982.— № 10. - С. 1163-1167.
5. Vollmer CA, Van Dyk TK. Stress responsive bacteria biosensors as environmental monitors. Adv Microb Physiol. 2004. - №49. – Р.131-174. doi: 10.1016/S0065-2911(04) 49003-1.