УСИЛЕНИЕ СИГНАЛА ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СТРЕПТОМИЦИНА

Фарафонова Ольга Вячеславовна

канд. хим. наук, доцент Липецкого государственного
технического университета, г. Липецк

Е-mail: 

Васильев Сергей Викторович

студент Липецкого государственного технического университета, г. Липецк

Ермолаева Татьяна Николаевна

д-р. хим. наук, профессор, профессор Липецкого государственного технического университета, г. Липецк

AMPLIFYING THE SIGNAL OF PIEZOQUARTZ IMMUNOSENSOR FOR STREPTOMYCIN DETERMINATION

Olga Farafonova

Candidate of Chem. Sciences, Associate Professor of Lipetsk State Technical University, Lipetsk

Sergey Vasiliev

Student Lipetsk State Technical University, Lipetsk

Tatuana Ermolaeva

Doctor of Chem. Sciences, Professor, Lipetsk State Technical University, Lipetsk

АННОТАЦИЯ

Разработана методика cинтеза наночастиц золота и их приме­нение для амплификации сигнала пьезокварцевого иммуносенсора для определения стрептомицина в проточно-инжекционном режиме. Показано влияние pH, природы и концентрации восстановителя и стабилизатора на процесс образования и устойчивость золотых наночастиц. Установлено, что применение наночастиц золота с диаметром 4 нм снижает предел обнаружения стрептомицина с 8 до 0,2 нг/мл и расширяет диапазон определяемых содержаний с 10—50 нг/мл до 0,8—120 нг/мл.

ABSTRACT

Developed the synthesis technique of gold nanoparticles and their application to signal amplification of piezoquartz immunosensor for the determination of streptomycin in the flow-injection mode. Shown the impact of pH, nature and concentration of the reducing agent and stabilizer to the formation and stability of the gold nanoparticles. Found that the use of gold nanoparticles with a diameter of 4 nm reduces the detection limit of streptomycin from 8 to 0.2 ng/ml and expands concentration range from 10—50 ng/ml to 0,8—120 ng/ml.

Ключевые слова: стрептомицин; сенсор; наночастицы золота.

Keywords: streptomycin; sensor; gold nanoparticles.

Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносенсора служит частотный сдвиг резонатора в результате образования иммунокомплекса на поверхности его электродов, поэтому для увели­чения чувствительности детектирования необходимо осуществлять формирование высокоаффинного слоя с высоким количеством доступных сайтов связывания для последующего комплементарного взаимодействия с молекулами антител, а также использовать наночастицы различной природы для конъюгирования с антителами, способствуя увеличению массы при образовании иммуноком­плекса [1]. Наиболее устойчивые конъюгаты с молекулами антител образуют частицы благородных металлов — золота и серебра. Достоинствами золотых наночастиц являются высокая плотность, обеспечивающая малые размеры частиц при большой массе, возможность получения частиц различного размера, относительная стабильность во времени. Развитие стратегии усиления сигнала пьезокварцевого сенсора с помощью золотых наночастиц показано на примере определения стрептомицина.

Стрептомицин наиболее распространенный аминогликозидный антибиотик, применяемый для лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, борьбы с ростом бактерий и грибков при культивировании овощей, фруктов и злаков, поэтому следовые концентрации препарата обнаруживаются в пищевых продуктах животного и растительного происхождения. Содержание стрептомицина в пище строго нормируется и не должно превышать 500 мкг/кг в мясе и печени, 1000 мкг/кг в почках, 200 мкг/л в молоке, 20 мкг/кг в меде, а в детском питании антибиотики должны и вовсе отсутствовать.

В настоящее время актуальной задачей является оптимизация методов получения наночастиц заданного размера, обладающих низкой полидисперсностью. Характеристики синтезируемых наночастиц в значительной мере зависит от технологии их получения. Традиционные способы синтеза, основанные на осаждении вещества из его пересыщенного раствора, не позволяют получать коллоидные системы с узкой дисперсностью [3, 4].

Исследованы условия синтеза наночастиц золота фиксированного размера из золотохлористоводородной кислоты с применением восстановителей (цитрат натрия, гидроксиламин солянокислый, хлорид олова, гидразин солянокислый, аскорбиновая кислота) и стабилизаторов (додецилсульфат натрия, полиэтиленгликоли 2000, 3000) при конвекционном нагревании. Концентрацию HAuCl₄ поддерживали постоянной — 0,4 ммоль/л. Показано, что при исполь­зовании в качестве восстановителя гидразина солянокислого в цитратной среде с присутствием стабилизатора ПЭГ 3000 обра­зуются наиболее устойчивые наночастицы золота со средним диаметром 5±4 нм. Размер синтезированных коллоидных наночастиц золота определяли спектрофотометрически в видимой области спектра по положению максимума плазмонного резонанса. Для уточнения размера наночастиц и установления их распределения по размерам применяли метод атомной силовой микроскопии. Растворы коллоидного золота наносили на графитовую подложку и высушивали потоком холодного воздуха [2]. Измерения проводили по стандартной методике с использованием программного обеспечения “NOVA”. Проведенные измерения позволили представить распределения частиц в виде гистограмм (рис. 1).

Рисунок 1. АСМ изображение наночастиц (5±4 нм), осажденных на графитовую подложку (а) и гистограмма распределения по размерам (б)

Для снижения дисперсности наночастиц золота изучен синтез в обратных микроэмульсиях. Преимущество такого способа получения наночастиц состоит в относительной простоте, возможности управлять размером получаемых частиц и одновременно проводить их стабилизацию.

Синтез наночастиц золота осуществляли путем восстановления золотохлористоводородной кислоты с помощью гидразина соляно­кислого и боргидрида натрия. В качестве неполярной среды применяли гексан, неионогенные и ионогенные поверхностно активные вещества. Показано, что диаметр наночастиц золота зависит от концентрации и природы ПАВ, обеспечивающего фиксированный размер микроэмульсий. Исследовано влияние соотношений концентраций восстановителя и ЗХВК, природу восстановителя. Установлено, что применение в качестве восстановителя боргидрида натрия приводит к большей интенсивности взаимодействия при получении наночастиц золота, а уменьшение концентрации ЗХВК приводит к пропорциональному снижению размера наночастиц золота. Степень дисперсности наночастиц снижается с увеличением их среднего размера, однако наиболее устойчивы коллоидные частицы диаметром 4—6 нм.

Для определения стрептомицина применяли конкурентный формат анализа, при осуществлении которого к пробе, содержащей аналит, вводили заранее установленное количество антител, соответствующее 50 %-ному связыванию и выдерживали в течение 2—3 минут до завершения образования гомогенного иммунного комплекса определяемого соединения с антителами. Затем пробу вводили в поток раствора-носителя, и после попадания ее в ячейку детектирования, измеряли аналитический сигнал сенсора при взаимодействии несвязавшихся антител с гаптен-белковым конъюгатом, иммобилизованным на поверхности электрода сенсора. Применение концентрации антител, соответствующей 50 % связы­ванию, позволяло достичь оптимального соотношения активных центров на поверхности иммуносенсора и количества молекул антител, не связавшихся в гомогенный иммунокомплекс со стрептомицином.

Для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора осущест­вляли конъюгацию антител с наночастицами золота, с образованием связей, не затрагивающих сайтов комплементарного взаимодействия и не оказывающих влияния на величину константы аффинности. Исследованы условия определения стрептомицина с применением антител сконъюгированных с наночастицами золота, рассчитаны коэффициенты усиления сигнала, рассчитанные как отношение аналитического сигнала сенсора при применении конъюгатов антител с наночастицами золота к сигналу сенсора, полученному при использовании немодифицированных антител. Получено, что максимальный аналитический сигнал сенсора наблюдается при использовании конъюгатов антител с наночастицами золота диаметром 4 нм, взятых в соотношении 1:2.

Применение наночастиц золота позволило снизить предел обнаружения с 8 нг/мл до 0,2 нг/мл. Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций 0,8—120 нг/мл. Правильность способа определения стрептомицина проверена методом «введено-найдено». Продолжительность анализа не превышает 20 минут.

Сенсоры апробированы при определения стрептомицина в курином мясе.

Список литературы:

1.Воронежцева О.В., Ермолаева Т.Н. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2011. Т. 11. № 1. С. 68—76.

2.Воронежцева О.В. Иммунохимические методы определения амино­гликозидных и тетрациклиновых антибиотиков, трициклических антидепрессантов.: Автореф. … дис. к-та хим. наук. Воронеж. 2011. 18 с.

3.Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Щеголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение. — М.: Наука, 2008. — 319 с.

4.Chithrani B. Devika, Ghazani Arezou A., Chan Warren C.W. // Nano Lett. 2006. V. 6 (4). p.p. 662—668.