ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЕРАПАМИЛА В СУДЕБНО- ХИМИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ

Кормишин Василий Алексеевич

Заочный аспирант кафедры химии фармацевтического факультета СамГМУ, г. Самара

E-mail kormishinva@inbox.ru

Воронин Александр Васильевич

канд. фармацевт. наук, доцент кафедры химии фармацевтического факультета СамГМУ, г. Самара

Шаталаев Иван Федорович

д-р биол. наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета СамГМУ, г. Самара

Введение. Широкое применение тонкослойной хроматографии (ТСХ) в судебно-химической экспертизе связано с высокой производительностью, простотой, достаточной специфичностью. Денситометрия обеспечивает ТСХ возможность количественного определения анализируемых веществ и документирования результатов. Высокая стоимость специализированного аналитического оборудования, в частности сканирующих денситометров и программного обеспечения, большинству лабораторий экспертных учреждений не позволяет использовать в полном объеме возможности ТСХ [3, с. 65].

Цель настоящей работы – определение аналитических характеристик и возможностей количественного определения методики судебно-химического исследования биологического материала на верапамил, методом ТСХ с применением программы «ТСХ-менеджер».

Материалы и методы. В данной работе были использованы методы: жидкость-жидкостной экстракции, тонкослойной хроматографии, денситометрии (с использованием компьютерной программы для обработки изображений «ТСХ-менеджер»), регрессионный и дисперсионный статистический анализы. Были использованы следующие материалы: стандартный раствор верапамила, модельные пробы мочи, содержащие определенные концентрации препарата, образцы мочи не содержащие психотропных веществ, экспертные образцы мочи, пластины для ТСХ «Сорбфил ПТСХ-П-А», системы растворителей для ТСХ.

Результаты и их обсуждение. Для исследования была выбрана методика анализа на верапамил методом ТСХ, используемая в практике судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. Условия хроматографического анализа: пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-А», хроматографическая система – а) этилацетат – метанол – 25 % раствор аммиака (17:2:1) [2, с. 56], б) метанол – 25 % раствор аммиака (100:1,5) [1, с. 89]; объем наносимой пробы – 100 мкл; проявление – обработка реактивом драгендорфа [5, с. 765].

Основной проблемой ТСХ-анализа верапамила с визуальной регистрацией является невозможность сохранения результатов – «пятна» (зоны на хроматограмме, соответствующей верапамилу) после проявления  теряют интенсивность окраски в течение 15-20 мин; и как следствие невозможность выполнения повторных измерений величины Rf и оценки количественного параметра – площади «пятна». Кроме того, фоновая составляющая хроматограммы выступает в роли значимого фактора, способствующего повышению величины предела обнаружения, т. е. снижению чувствительности анализа.

Пластинки после хроматографирования, проявления и высушивания сканировали на планшетном сканере или фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата, полученные файлы формата jpeg обрабатывали с помощью программы «ТСХ-менеджер», версия 3.12 (разработчик Плахотний Игорь Николаевич). Таким образом, сама хроматографическая пластинки утрачивала значение носителя аналитической информации, ее замещал электронный образ.

Для приготовления растворов стандартных образцов использовали метанольный раствор верапамила концентрации 10,0 мг/мл( производитель «Киевмедпрепарат»). Модельные растворы мочи готовили путем добавления расчетного количества вышеуказанных растворов в образцы мочи, не содержащие наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ.

При исследовании растворов стандартных образцов верапамила в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл проводили по 10 параллельных определений. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Аналитические характеристики методики определения верапамила методом тонкослойной хроматографии

1*- этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1)

2*- метанол-25% раствор аммиака (100:1,5)

Уменьшение величины предела обнаружения вносят растровые манипуляции с электронным образом хроматограммы – изменение резкости, интенсивности изображения, изменение параметров яркости и контрастности, возможность просмотра хроматограммы в негативе. Указанные манипуляции позволяют сделать почти незаметное для человеческого глаза «пятно» анализируемого вещества четко детектируемым. На основании полученных результатов окно поиска Rf для верапамила было задано на уровне 0,06.

Градуировочная зависимость «площадь пятна (Y) – количество верапамила, мкг (X)», построенная в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл, описывается уравнением полиномиальной регрессии (второй степени). Однако для установления данной зависимости необходимо использовать более трех растворов стандартного образца вещества различных концентраций (калибраторов), что в условиях повседневной аналитической практики приведет к снижению производительности анализа. Для упрощения задачи нами было предложено применение линейной регрессии, при этом количество калибраторов было уменьшено до двух. Вышеуказанные зависимости были определены для вариантов анализа с применением в качестве источника электронного образа хроматограммы планшетного сканера и цифрового фотоаппарата (табл. 2).

Таблица 2. Градировочные характеристики количественного денситометрического определения верапамила

Результаты контроля правильности методики определения верапамила с применением контрольных растворов данных веществ (приготовленных независимо от калибраторов) представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты контроля правильности количественного денситометрического определения верапамила

* – концентрация 10,0 мкг/мл при объеме, наносимой на пластинку пробы 100 мкл соответствует пределу обнаружения.

Относительная ошибка определения среднего значения содержания верапамила в пробе в диапазоне концентраций 10,0-250,0 мкг/мл не превышает 33 % при использовании для получения электронного образа хроматограммы цифрового фотоаппарата 16,5 % в случае сканирования хроматографических пластинок, последний вариант является наиболее предпочтительным. Наименьшая величина ошибки достигается при концентрации препарата 100 мкг/мл.

Параллельно проводили измерения с модельными образцами мочи. К моче не содержащей наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ добавляли рассчитанное количество стандартного раствора препарата. К моче добавляли 25 % раствор аммиака до рН 10-11, затем добавляли равный объём смеси хлороформ – н-бутанол (9:1) [4, с. 445] встряхивали в течении 15 минут, органическую фазу сливали, к водной части добавляли такой же объём органической фазы процедуру повторяли. Водный раствор отбрасывали, органическую фазу упаривали в токе воздуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 100 мкл хлороформа и наносили на ТСХ пластину хроматографировали с последующей денситометрией. Параллельно ставили контрольный опыт с «холостой пробой». Процент выхода вещества по данной методике составил 60 % .

Заключение.

Таким образом, денситометрия электронных образов хроматограмм является современным, экспрессным и объективным вариантом анализа в тонкослойной хроматографии, значительно расширяющим возможности этого классического метода.

Список литературы

1.            Бабаханян Р. В., Бушуев Е. С., Варданян Ш. А., Афанасьев В. В. Наркотические средства, психотропные и сильнодействующие вещества – СПБ; Реноме, 2008 -276 с.

2.            Еремин С. К. Анализ наркотических средств / Еремин С. К., Изотов Б. Н., Веселовская Н. В.; Под ред. Изотова Б. Н. – М.: Мысль, 1993. – 270 с.

3.            Симонов Е. А. Наркотики: методы анализа на коже, в ее придатках и выделениях / Симонов Е. А., Изотов Б. Н., Фесенко А. В. – М.: Анахарсис, 2000. – 130 с.

4.            Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие / Под. ред. проф. Калетиной Н. И.- М.:ГЭОТАР- Медиа, 2008.-1016 с.:ил.

5.            CLARKE`S Isolation and identification of drugs in pharmaceutical body fluids, and post –mortem material. London The pharmaceutical press 1986. 1134 с.