ПРИЗНАКИ  НАРУШЕНИЯ  КЛЕТОЧНОЙ  ЭНЕРГОСПОСОБНОСТИ  ГЕПАТОЦИТОВ  ПРИ  ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ  ЦИРРОЗЕ

Лебедева  Елена  Ивановна

аспирант  каф.  гистологии,  цитологии  и  эмбриологии,  Витебский  государственный  медицинский  университет,  Республика  Беларусь,  г.  Витебск

E-mail: 

В  настоящее  время  повсеместно  прослеживается  четкая  тенденция  к  росту  заболеваемости  циррозом  печени,  склонность  к  затяжному  и  рецидивирующему  его  течению,  переходу  в  злокачественные  формы  [3,  с.  25].  Смертность  от  цирроза  печени  в  Беларуси  в  2009  г  составила  23,9  %,  из  них  показатель  смертности  от  алкогольного  цирроза  печени  составил  6,0  %,  в  2010  г  —  24,9  %  и  1,7  %  соответственно.  Несмотря  на  то,  что  уровень  вклада  цирроза  печени  в  ассоциированную  с  алкоголем  смертность  варьирует  в  исследованиях  разных  авторов,  считается  общепризнанным,  что  не  менее  50  %  всех  смертей  от  цирроза  печени  обусловлены  злоупотреблением  алкоголем.  С  2000  по  2011  гг  контингент  больных  хроническим  алкоголизмом  и  алкогольным  психозом  в  Беларуси  вырос  на  44,6  %  (с  1426,9  до  2062,7  на  100  тыс.  населения)  [2,  с.  33].

Большинство  имеющихся  в  настоящее  время  данных  свидетельствуют  о  том,  что  функция  электрон-транспортной  цепи  митохондрий  при  циррозе  заметно  ослабляется.  Следствием  снижения  активности  дыхательной  цепи  является  уменьшение  эффективности  окислительного  фосфорилирования  и  продукции  АТФ  митохондриями.  Следует,  однако,  отметить,  что  данные  о  состоянии  митохондриального  аппарата  гепатоцитов  при  циррозе  не  столь  однозначны.  В  ряде  работ  показано,  что  активность  ферментов  митохондрий  гепатоцитов  при  различных  хронических  поражениях  печени  не  отличается  от  нормы  [1,  с.  288]. 

Для  диагностики  митохондриальных  нарушений  используются  клинические,  биохимические  и  молекулярно-генетические  методы.  Одно  из  ведущих  мест  в  современной  диагностике  митохондриальных  нарушений  занимают  морфологические  исследования.  В  то  же  время,  в  научной  литературе  отсутствует  систематизированное  описание  морфологических  проявлений  митохондриальной  недостаточности. 

Целью  исследования  явилось  изучение  признаков  нарушения  клеточной  энергоспособности  гепатоцитов  у  экспериментальных  животных  с  моделью  токсического  цирроза,  вызванного  интоксикацией  четыреххлористым  углеродом  (ССL₄)  и  этанолом.

Материал  и  методы.  Экспериментальная  часть  работы  была  выполнена  на  базе  НИЛ  Витебского  государственного  медицинского  университета.  Биохимические  и  морфологические  исследования  выполнены  в  НИИПВМ  и  Б  Витебской  ордена  «Знак  Почета»  государственной  академии  ветеринарной  медицины.  Исследование  выполнено  на  162  половозрелых  беспородных  белых  крысах  (Rattus  rattus  L.)  обоего  пола  массой  180—250  г  в  осенне-зимний  период.  Животные  содержались  в  пластико-металлических  клетках  с  опилками,  по  6  особей  в  каждой  клетке,  при  естественном  освещении,  со  свободным  доступом  к  корму  и  воде.  Все  исследования  проводили  в  одно  и  то  же  время  суток,  с  соблюдением  принципов,  изложенных  в  Конвенции  по  защите  позвоночных  животных,  которые  используют  в  экспериментальных  и  других  научных  целях  (г.  Странбург,  1986),  и  согласно  правилам  лабораторной  практики  РБ  (приложение  к  приказу  Министерства  Здравоохранения  Республики  Беларусь  №  31  от  31.10.2006).  Животные  были  разделены  на  группы:  опытные  (n=12,  6  самцов  и  6  самок),  контрольные  (n=12,  6  самцов  и  6  самок)  и  интактные  (n=12,  6  самцов  и  6  самок).  Токсическое  поражение  печени  моделировали  путем  длительного  внутрижелудочного  введения  40  %-го  масляного  раствора  ССL₄  2  раза  в  неделю  в  утренние  часы  за  4  часа  до  кормления.  Параллельно  с  этим  вместо  воды  в  качестве  питья  крысы  получали  5  %-ный  раствор  этанола  из  поилок  в  режиме  свободного  доступа  в  течение  19  недель.  Контрольные  (плацебо)  животные  получали  эквиобъемное  количество  растворителя  ССL₄  (оливковое  масло)  и  в  качестве  питья  использовали  кипяченую  воду  из  поилок  в  режиме  свободного  доступа.  Интактные  животные  —  крысы  того  же  возраста  и  веса,  что  и  экспериментальные. 

В  качестве  материала  для  биохимических  исследований  использовали  сыворотку  крови  животных,  которую  получали  по  общепринятой  методике.  Для  определения  активности  аланинаминотрасферазы  (GPT,  U/L)  и  аспартатаминотрансферазы  (GOT,  U/L)  использовали  кинетичекский  метод  IFCC  без  пиридоксаля,  щелочной  фосфатазы  (ALP,  U/L)  —  кинетичекский  метод  с  образованием  4-нитрофенола,  гаммаглутамилтранспептидазы  (γ-GGT,  U/L)  —  кинетичекский  метод.  Для  оценки  углеводного  обмена  у  контрольных  и  экспериментальных  животных  определяли  содержание  глюкозы  (Gl,  ммоль/л)  ферментативным  методом.  Биохимические  анализы  выполнялись  на  биохимическом  автоматическом  анализаторе  EuroLyser  (EUROLab,  Instruments  GmbH;  Австрия)  с  использованием  стандартных  диагностических  наборов  реактивов  фирмы  «Cormay»  (Польша).  Все  биохимические  исследования  были  выполнены  в  день  забора  крови.

Материалом  для  патоморфологических  исследований  служили  фрагменты  нормальной  и  патологически  измененной  левой  боковой  доли  печени  животных.  Для  выявления  общих  гистологических  изменений  фрагменты  органа  фиксировали  в  10  %-ном  нейтральном  формалине  и  смеси  Гелли.  Проводку  осуществляли  в  автомате  для  гистологической  обработки  ткани  STP-120  (тип  карусель,  Германия),  заливку  —  на  станции  для  заливки  ткани  парафином  EC350  (Германия).  С  каждого  блока  с  помощью  ротационного  микротома  НМ  340Е  (MICROM,  Laborgerate  GmbH;  Германия)  получали  серийные  срезы  (толщина  срезов  около  4—5  мкм)  и  окрашивали  гематоксилином  и  эозином  в  автоматическом  программируемом  приборе  для  цитологических  и  гистологических  методик  HMS70  (Германия).  Ранние  фибропластические  изменения  выявляли  при  помощи  окраски  трихромом  по  Массону  вручную.  Гликоген  выявляли  по  методу  Шабадаша.  В  нефиксированных  срезах  печени  (около  10  мкм),  приготовленных  на  микротоме-криостате  НМ525  (MICROM,  International  GmbH;  Германия),  гистохимически  определяли  активность  сукцинатдегидрогеназы  по  методу  Нахласа  с  нитро-СТ,  содержание  общих  липидов  суданом  III,  IV  и  по  методу  Лизона.  Приготовление  красителей,  буферных  растворов,  постановку  соответствующих  контролей  проводили  в  соответствии  с  прописями,  проведенными  в  руководствах  (Г.А.  Меркулов,  1969;  Б.  Ромейс,  1953;  Э.  Пирс,  1962;  Р.  Лилли,  1969). 

Микроскопическое  исследование  проводили  с  помощью  микроскопа  OLYMPUS  BX  51  со  встроенной  видеокамерой  OLYMPUS  XC  30  (Япония).  Степень  фиброзных  изменений  печени  оценивали  по  шкале  Knodell.

Статистический  анализ  полученных  результатов  проводили  в  табличном  процессоре  Microsoft  Office  Excel  2007  и  STATISTIKA  6,0.  Статистическую  значимость  различий  данных  опыта  и  контроля  оценивали  с  использованием  непараметрического  U-критерия  Манна-Уитни.  Статистически  значимыми  считали  различия  при  р<0,05.

Результаты  исследования.  У  крыс,  подвергшихся  в  течение  19  недель  интоксикации  ССL₄,  развивался  типичный  цирроз  печени.  Печень  при  макроскопическом  исследовании  была  увеличена  в  размерах,  имела  красновато-желтую  окраску,  поверхность  ее  была  неоднородная,  бугристая  за  счет  узлов  разного  диаметра.  Край  печени  был  закруглен.

При  анализе  трансминаз  в  сыворотке  крови  животных  с  циррозом  печени  были  установлены  увеличение  GPT  у  самцов  в  5,3  раза,  а  у  самок  в  9,2  раза  по  сравнению  с  контрольной  группой  (63,38±0,45  и  336,58±0,55;  52,49±0,47  и  484,35±0,43,  р<0,002  соответственно),  GOT  у  самцов  —  в  1,9  раза,  а  у  самок  —  в  2,3  раза  (154,96±0,95  и  304,45±0,53;  155,36±0,76  и  351,90±0,46,  р<0,002  соответственно).  Повышение  активности  трансаминаз  рассматривают  как  весьма  чувствительный  критерий  степени  тяжести  повреждения  клеток  печени. 

Повышенное  содержание  ALP  у  самцов  (в  3,6  раза)  и  у  самок  (в  1,6  раза  94,71±1,41  и  345,38±0,42;  159,04±2,28  и  259,01±0,48,  р<0,002  соответственно)  по  сравнению  с  контрольной  группой  свидетельствует  о  явлениях  холестаза. 

По  сравнению  с  контрольной  группой  возрастала  активность  γ-GGT:  у  самцов  —  в  2,5  раза,  а  у  самок  —  в  3,7  раза  (8,65±0,36  и  21,95±0,28;  8,35±0,32  и  31,12±0,33,  р<0,002  соответственно).  Повышение  уровня  γ-GGT  указывает  на  стимуляцию  активности  микросомальных  ферментов.  Описанные  изменения  в  активности  ферментов-маркеров  токсического  поражения  печени  свидетельствуют  об  активно  протекающих  процессах  повреждения  гепатоцитов. 

У  экспериментальных  животных  отмечалось  уменьшение  глюкозы  в  сыворотке  крови  у  самцов  в  1,9  раза,  а  у  самок  —  в  1,5  раза  (13,07±0,50  и  6,68±0,15;  11,18±0,26  и  7,50±0,22,  р<0,002  соответственно)  по  сравнению  с  контрольной  группой.  Полученные  данные  позволили  утверждать  о  развитии  тяжелого  гепатотоксического  действия  ССL₄,  являющегося  одной  из  причин  развития  гипогликимии.

Гистологическое  исследование  срезов  печени  контрольных  крыс  показало,  что  структура  паренхимы  типична  для  нормального  органа.  Морфологические  исследования  ткани  печени  подопытных  крыс  выявили  значительные  изменения  по  сравнению  с  контрольными.  Наблюдались  белковая,  гидропическая  и  жировая  дистрофия  гепатоцитов  с  выраженным  серозным  отеком  паренхимы,  потеря  балочной  структуры  паренхимы  печени,  интенсивное  разрастание  соединительной  ткани,  узловая  трансформация  паренхимы  печени  с  образованием  ложных  долек,  разделенных  между  собой  фиброзными  тяжами.  Наряду  с  дистрофией,  некробиозом,  некрозом,  фибробластическими  процессами  и  перестройкой  печеночных  долек  наблюдались  признаки  слабовыраженной  регенераторной  активности  гепатоцитов.  Все  перечисленные  морфологические  изменения  у  самок  были  менее  выраженными,  чем  у  самцов,  но  при  этом  диффузная  мелко-  и  крупнокапельная  липидная  инфильтрация  была  наиболее  интенсивно  выражена  у  самок.  Степень  фиброза  соответствовала  4-м  баллам  по  шкале  Knodell. 

При  изучении  гистохимической  активности  фермента  внутренней  мембраны  митохондрий  СДГ  у  подопытных  крыс  были  обнаружены  характерные  отклонении  экспрессии  фермента  от  контроля.  На  гистохимических  препаратах  отчетливо  выделялись  три  группы  клеток:  с  высокой,  средней  и  низкой  активностью.  Среди  печеночных  долек  преобладали  такие,  в  которых  активность  фермента  была  низкой.  Вместе  с  тем,  в  меньшем  количестве  обнаруживались  дольки,  в  которых  гепатоциты  демонстрировали  среднюю  и  высокую  активность,  причем  такие  гепатоциты  располагались  по  периферии  дольки.  На  препаратах  ложные  дольки  большого  диаметра  с  высокой  активностью  фермента  всех  гепатоцитов  встречались  редко.  Чаще  встречались  дольки  большого  диаметра,  у  которых  расположение  гепатоцитов  со  средней  и  низкой  степенью  активности  фермента  было  группами.  При  прорастании  дольки  большого  диаметра  соединительной  тканью  гепатоциты  с  высокой  ферментативной  активностью  располагались  вдоль  соединительной  ткани.

В  цирротически  измененной  печени  наблюдалось  снижение  содержания  гликогена  в  гепатоцитах.  Встречались  клетки  с  крупноглыбчатым,  агрегированным  гликогеном,  а  также  клетки,  где  гликоген  отсутствовал.  Редко  встречались  перегруженные  гликогеном  гепатоциты,  в  которых  зерна  гликогена  заполняли  всю  цитоплазму.  На  контрольных  препаратах  гликоген  выявлялся  в  виде  мелких  и  крупных  зерен  пурпурно-красного  цвета. 

Выводы.  Установлено,  что  изменения  активности  индикаторных  ферментов  токсического  поражения  печени,  выявленная  гипогликемия,  снижение  уровня  гистохимической  реакции  по  выявлению  митохондриального  фермента  сукцинатдегидрогеназы,  уменьшение  содержание  гликогена  в  гепатоцитах  свидетельствует  о  нарушениях  энергетического  обмена  гепатоцитов  у  крыс  с  циррозом  печени  и  снижением  клеточной  энергоспособности.

Список  литературы:

1. Безбородкина  Н.Н.  Морфометрия  митохондриального  аппарата  гепатоцитов  нормальной  и  цирротически  измененной  печени  крыс  //  Цитология.  —  2008.  —  Т.  50,  —  №  3.  —  С.  228—235.
2. Здравоохранение  в  Республике  Беларусь:  официальный  статистический  сборник  за  2011  г.  Минск:  ГУ  РНМБ,  2012.  —  304  с.
3. Разводовский  Ю.Е.  Смертность  от  цирроза  печени  в  Беларуси  в  период  с  1981  по  2001  г.  //  Здравоохранение.  —  2007.  —  №  7.  —  С.  25—28.