СРАВНИТЕЛЬНОЕ  ИЗУЧЕНИЕ  ВОЗДЕЙСТВИЯ  НЕКОТОРЫХ  СОЕДИНЕНИЙ  ЦИНКА  НА  АКТИВНОСТЬ  КУЛЬТУРЫ  SACHAROMYCES  CEREVISIAE

Ларин  Сергей  Леонидович

аспирант  кафедры  общей  и  биоорганической  химии, 
Курского  государственного  медицинского  университета

РФ,  г.  Курск

E-mail: 

Будко  Елена  Вячеславовна

д-р  фарм.  наук,  зав.  кафедрой  общей  и  биоорганической  химии,  профессор  Курского  государственного  медицинского  университета

РФ,  г.  Курск

E-mail: 

Хабаров  Анатолий  Алексеевич

д-р  фарм.  наук,  профессор  кафедры  общей  и  биоорганической  химии, 
Курского  государственного  медицинского  университета

РФ,  г.  Курск

E-mail: 

COMPARATIVE  STUDY  OF  THE  EFFECTS  OF  CERTAIN  ZINC  COMPOUNDS  ON  THE  ACTIVITY  OF  SACHAROMYCES  CEREVISIAE  CULTURE

Sergei  Larin

postgraduate  of  the  department  of  general  and  bioorganic  chemistry, 
Kursk  State  Medical  University, 
Russia,  Kursk

Elena  Budko

doctor  of  pharmaceutical  sciences,  head  of  the  department  of  general  and  bioorganic  chemistry, 
Kursk  state  medical  university, 
Russia,  Kursk

Anatoliy  Khabarov

doctor  of  pharmaceutical  sciences,  professor  of  the  department  of  general  and  bioorganic  chemistry, 
Kursk  state  medical  university, 
Russia,  Kursk

АННОТАЦИЯ

В  работе  проведено  сравнительное  изучение  воздействия  некоторых  соединений  Zn²⁺  на  активность  культуры  S.Cerevisiae.  Активность  хлебопекарных  дрожжей  определялась  по  ускоренному  методу  определения  подъемной  силы.  Выявлен  сопоставимый  токсический  эффект  малорастворимого  Zn(OH)₂  и  раствора  ZnSO₄  при  количествах  Zn  10-100  мг/г.  Незначительное  ингибирование  ферментативной  активности  дрожжей  выявлено  для  ZnO,  особенно  для  его  микронизированной  формы.

ABSTRACT

This  paper  represents  a  comparative  study  of  the  effects  of  certain  Zn  compounds  on  the  S.Cerevisiae  culture.  The  activity  of  the  yeast  was  determined  by  an  accelerated  method  of  determining  the  lifting  force.  Identified  a  comparable  toxic  effect  of  poorly  soluble  Zn  (OH)₂  and  ZnSO₄  solution  in  the  quantities  of  Zn  10-100  mg/g.  A  slight  inhibition  of  enzyme  activity  found  for  ZnO,  especially  for  its  micronized  form.

Ключевые  слова:  цинк;  сульфат;  цинка  оксид;  малорастворимые  соединения;  токсичность;  дрожжи;  ферменты.

Keywords:  zinc  sulfate;  zinc  oxide;  poorly  soluble  compound;  toxicity;  yeast;  enzymes.

Введение.  Известно,  что  ионы  цинка  являются  кофактором  целого  ряда  ферментов  и,  как  следствие,  оказывают  существенное  влияние  на  нормальное  протекание  биохимических  процессов  в  живом  организме:  белковый  обмен,  дифференцирование  клеток  и  др.  [1].  Поэтому  Zn²⁺  в  витальных  дозах  в  большинстве  случаев  оказывает  на  ферментные  системы  активирующее  действие  [6].  Однако  не  исключается  и  индукция  процессов  и,  как  следствие,  гибель  клеток.  Уровень  токсичности  соединений  зависит,  в  том  числе  от  размера  частиц  и  их  ионизации,  эффективности  абсорбции.  Традиционно  для  введения  цинка  в  организм  используются  растворимые  соединения.  Ранее  нами  было  показано,  что  культивация  дрожжей  хлебопекарных  может  быть  проведена  в  питательной  среде,  с  добавлением  соли  цинка,  причем  только  сульфат  сохраняет  и  повышает  активность  дрожжей.  Это  может  быть  связано  как  с  концентрацией  аниона  в  растворе,  так  и  с  его  вовлечением  в  метаболические  процессы  дрожжевых  клеток.  Значительный  интерес  для  дальнейших  исследований  представляет  поиск  соединений  нетоксичных  для  дрожжевых  клеток  и  являющихся  источником  максимального  количества  цинка,  при  этом  имеются  данные  о  проявлении  биологической  активности  и  малорастворимыми  соединениями  [3;  5;  7].  От  выбора  объекта  исследования  зависит  получаемый  эффект,  а  на  его  интенсивность  влияют  характеристики  частиц.  В  эксперименте  на  крысах  при  однократном  внутрижелудочном  введении  острая  токсичность  нанодиспергированного  цинка  оксида  оказалась  значительно  ниже,  чем  у  традиционной  солевой  формы  цинка  сульфата  [3].  Однако  отмечено  токсическое  воздействие  наночастиц  оксида  цинка  на  клетки,  при  этом  выявлена  полная  ионизация  оксида  в  живом  организме.

Культура  S.  Cerevisiae  позволяет  моделировать  многие  клеточные  процессы,  связанные  с  работой  ферментов.  Простейший  комплекс  превращений  под  действием  зимазного  комплекса  ферментов  широко  распространен  практически  у  всех  живых  организмов.  Эффективность  процесса  спиртового  брожения  определяется  целым  рядом  ферментов:  α-глюкозидазой,  мальтопермеазой,  фруктоизомеразой,  β-фруктофуранозидазой,  карбоксилазой  и  др.  Большинство  из  них  не  содержат  Zn²⁺  в  своей  структуре,  поэтому  действие  соединений  цинка  в  отношении  данных  ферментативных  систем  может  проявляться  в  ингибировании  активности  культуры  хлебопекарных  дрожжей.  Ранее  нами  проводилось  исследование  активности  дрожжей  в  питательной  среде,  с  добавлением  растворимых  солей  цинка,  При  этом,  для  эквимолярных  количествах  солей  выявлено  токсическое  воздействие  ацетата  и  хлорида  и  отсутствие  угнетения  активности  дрожжей  при  использовании  сульфата  цинка.  Значительный  интерес  для  дальнейших  исследований  представляет  поиск  соединений  нетоксичных  для  дрожжевых  клеток  и  являющихся  источником  максимального  количества  цинка  [2].

Целью  данной  работы  являлось  сравнительное  изучение  воздействия  растворимого  и  некоторых  малорастворимых  разноразмерных  соединений  цинка  на  активность  культуры  хлебопекарных  дрожжей  S.  Cerevisiae. 

Материалы  и  методы.  В  эксперименте  использованы  промышленные  образцы  соединений  цинка  ZnSO₄  (ХЧ,  ГОСТ  4174-77,  Реахим,  СПб),  ZnO  (ХЧ,  ГОСТ  10262-73,  Реахим,  СПб)  и  образцы  полученные  в  лабораторных  условиях:  ZnO  микронизованный,  Zn(OH)₂.  Микронизацию  окиси  цинка  (ХЧ,  ГОСТ  10262-73,  Реахим,  СПб)  проводили  с  использованием  мельницы  шаровой  вибрационной  МЛ-1  во  временном  режиме  15  минут  [4].  Zn(OH)₂  получали  сливанием  растворов  ZnCl₂  (ХЧ,  ГОСТ  4529-78,  Реахим,  СПб)  и  KOH  (ХЧ,  ГОСТ  24363-80,  Реахим,  СПб)  с  последующей  фильтрацией  и  сушкой  при  25  ^оС. 

Активность  дрожжей  определяли  по  ускоренному  методу  определения  подъемной  силы.  От  средней  пробы  дрожжей  хлебопекарных  прессованных  высокоактивных  «Премиум»  (ОАО  «Комбинат  пищевых  продуктов»,  СПб,  Россия,  ТУ  9182–008–00353595–2004)  отбирали  равные  навески  и  к  ним  примешивали  массы  одного  из  соединений  цинка  в  количествах  эквивалентных  по  содержанию  элемента  в  моле  соединения.  Серию  разведений  готовили  с  помощью  чередования  операций  деления  массы  смеси  на  две  равные  части  и  восстановления  исходной  массы  добавлением  новой  порции  дрожжей.  Данная  методика  позволила  исключить  ошибки  взвешивания  малых  масс  и  позволила  получить  тритурации  с  содержанием  цинка  до  1  мг  на  1  г  дрожжевой  смеси.

Из  одинаковых  по  массе  и  разных  по  содержанию  цинка  дрожжевых  смесей  готовили  суспензию  в  2,5  %  растворе  NaCl  (ХЧ,  ГОСТ  4233-77,  Реахим,  СПб),  которую  соединяли  с  мукой  пшеничной  (ГОСТ  Р  52189)  и  замешивали  тесто  с  приданием  ему  формы  шарика,  шарик  помещался  в  стакан  с  водой  температуры  35  ^оС  и  термостатировался.  Для  каждой  серии  опытов  проводилась  «холостая»  проба.  Количество  параллельных  опытов  5–6.  Результаты  переводили  в  относительные  единицы  и  проводили  анализ  с  использованием  программного  обеспечения  MS  Excel  14  и  OriginPro  8.5.1.

Результаты  и  обсуждение.  При  выборе  растворимой  соли  цинка  мы  остановились  на  сульфате,  так  как  полученные  ранее  результаты  показали  безусловную  токсичность  хлорида  и  ацетата.  Для  дальнейших  исследований  мы  выбрали  соединения  с  максимальной  долей  цинка  при  отсутствии  сложных  противоионов  –  оксид  и  гидроксид.  Полученные  в  результате  эксперимента  зависимости  степени  изменения  подъемной  силы  (%)  от  доли  введенного  цинка  представлены  на  рисунке  1. 

Рисунок  1.  Зависимость  степени  изменения  подъемной  силы  дрожжей  (%)  от  массы  Zn²⁺  для  Zn(OH)₂  (1),  ZnSO₄  (2),  ZnO  (3),  ZnO  микронизованный  (4)

При  подъемной  силе  контрольной  пробы  100  %  большинство  полученных  проб  показало  увеличение  времени  подъема  в  1,25–1,5  раза.  Из  рис.  1  очевидно,  что  все  исследуемые  соединения  в  стартовых  количествах  ингибируют  процесс  ферментации.  Наибольшим  угнетающим  эффектом  в  отношении  дрожжевой  системы  обладают  цинка  гидроксид  (кривая  1)  и  цинка  сульфат  (кривая  2).  Стоит  отметить,  что  на  стартовых  количествах  угнетающее  воздействие  у  цинка  сульфата  ниже,  чем  у  гидроксида  цинка.  В  исходных  массовых  уровнях  цинка  оксид  наноразмерный  (кривая  4)  проявлял  меньшее  воздействие  на  клетки  дрожжей,  чем  цинка  оксид  технический  (кривая  3)  в  среднем  на  12–15  %.  Снижение  масс  соединений  до  милли-  и  микрограммовых  количеств  цинка  на  грамм  дрожжевой  смеси  во  всех  исследуемых  пробах  сопровождается  ослабеванием  угнетающего  эффекта.  Подъемная  сила  дрожжей  в  сериях  с  цинка  сульфатом  и  гидроксидом  устанавливается  на  исходном  уровне  холостой  пробы.  При  этом  нами  отмечено  некоторое  повышение  активности  дрожжей  в  смесях  с  микронизированным  цинка  оксидом,  и  стабильное  ингибирование  ферментов  зимазного  комплекса  ZnO  техническим. 

Исходя  из  строения  дрожжевой  клетки,  в  ходе  эксперимента  наблюдается  ингибирование  экзогенных  ферментов  зимазного  комплекса.  Отсутствие  активности  адаптивных  ферментов  можно  объяснить  их  ингибированием  в  результате  проникновения  ионов  внутрь  дрожжевых  клеток.  Известно,  что  перемещение  ионов  между  наружной  средой  и  цитоплазмой  клетки  происходит  через  специфический  транспортный  механизм.  Вид  кривой  изменения  подъемной  силы  для  сульфата  предполагает  ограничение  проникновения  элемента  в  клетку  из  растворов  с  достаточно  высокими  концентрациями  соли,  что  можно  расценить  как  насыщение  транспорта  или  конечную  скорость  ионизации.  Кроме  того,  относительно  небольшая  ингибирующая  активность  сульфата  цинка,  по  нашему  мнению,  связана  с  участием  аниона  в  нормальных  метаболических  процессах.  Исходя  из  графической  зависимости,  следует  отметить,  что  ослабление  воздействия  цинка  гидроксида  подобно  по  скорости  аналогичным  значениям  для  растворимого  соединения.  При  этом  все  полученные  графики  сближаются  с  линией  100  %  при  одинаковом  молярном  содержании  цинка  в  изучаемых  соединениях. 

Согласно  современным  представлениям,  селективность  ионного  канала  определяется  радиусом  транспортируемого  иона  и  его  способностью  взаимодействовать  с  оптимальным  числом  фиксированных  полярных  групп  канала.  Для  стерического  соответствия  важна  характеристика  окружения  иона  как  в  качественном,  так  и  в  количественном  отношении.  Ионы  в  водном  растворе  всегда  находятся  в  гидратированном  состоянии,  причем  ионы  [Zn(OH)₆]²⁺  считаются  источником  токсичности.  Цинка  гидроксид  способен  к  частичной  диссоциации,  а  также  к  гидратации  за  счет  подобия  ионов.  Следовательно,  вполне  вероятен  перенос  цинка  из  гидроксида  в  клетку  через  ионные  каналы,  при  этом  его  высокая  активность  при  стартовых  количествах  (кривая  1)  предполагает  большую,  чем  у  сульфата  готовность  проходить  через  ионные  каналы. 

Работы  ряда  авторов  дают  неоднозначную  информацию  о  биологических  свойствах  цинка  оксида.  Цинка  оксид  обладает  определенной  растворимостью  (4,2×10^-6  г/мл  [5])  и,  следовательно,  его  частицы  диссоциированы  и  солюбилизированы.  Доказаны  отсутствие  инертности  и  дозозависимая  токсичность  его  измельченных  порошков,  причем  повышение  степени  дисперсности  часто  связывают  с  повышением  биологической  активности.  Использованный  нами  цинка  оксид  технический  имел  частицы  неправильной  геометрической  формы.  При  проведении  микронизации  на  шаровой  вибрационной  мельнице  МЛ-1  были  получены  частицы  также  неправильной  формы.  Микронизованный  ZnO  (кривая  4)  показал  минимальное  токсическое  воздействие  на  ферментативную  активность  относительно  всех  исследованных  соединений,  причем  только  для  этой  формы  выявлена  активация  дрожжей  на  10–15  %.  Проявление  незначительной  токсичности  цинка  оксидом  в  отношении  культуры  клеток  позволяет  предположить  низкую  скорость  процессов  диссоцииации  и  гидратации  или  различия  в  механизме  абсорбции.  Возможно  также,  что  оксид  цинка  активизирует  другие  физиологические  процессы,  опосредованно  активизирующие  реакцию  ферментации. 

Выводы.  Растворимые  и  малорастворимые  соединения  цинка  при  воздействии  на  клетки  дрожжей  вызывают  сопоставимые  эффекты.  В  высоких  дозах  эквимолярные  количества  малорастворимого  Zn(OH)₂  и  растворимого  ZnSO₄  значительно  ингибируют  процесс  сбраживания,  причем  в  стартовых  дозах  гидроксид  оказал  на  культуру  вдвое  более  сильный  токсический  эффект.  По  нашему  мнению,  это  может  быть  показателем  способности  частиц  гидроксида  цинка  к  преодолению  клеточной  мембраны  в  результате  диссоциации  и  гидратации.  Соединение  с  наименьшей  дисперсностью  –  микронизованный  на  шаровой  мельнице  цинка  оксид  –  не  только  обладает  минимальным  токсическим  эффектом  в  сравнении  с  другими  изучаемыми  соединениями,  но  в  количествах  на  уровне  миллиграмма  оказывает  стимулирующее  воздействие  на  культуру  S.  Cerevisiae. 

Средняя  активность  культуры  клеток  является  показателем  стресса,  токсических  эффектов,  направленности  метаболизма  и  общей  жизнеспособности.  Токсические  эффекты  частиц  в  культуре  ткани  могут  быть  связаны  с  двумя  различными  действиями:  (I)  химической  токсичности,  например,  образование  ионов,  участвующих  в  ферментативных  реакциях  как  ингибиторы;  или  (II)  в  результате  нарушения  поверхности,  вызванного  размерами  и/или  формой  частиц.  Процесс  сбраживания  дрожжевой  клеткой  теста  основывается  на  действии  зимазного  комплекса  ферментов,  которые  не  содержат  в  своем  составе  ионов  Zn²⁺.  На  наш  взгляд  это  обусловило  ингибирование  активности  экзоферментов  дрожжевой  культуры,  т.  е.  эффект  можно  отнести  к  чисто  химическому  воздействию  растворенных  ионов  цинка.  Дальнейшие  сравнительные  исследования  влияния  растворимости,  размера  и  формы  частиц  химических  соединений  на  их  биологическую  активность  может  быть  легко  проведено  на  культуре  клеток  in  vitro.

Список  литературы:

1. Будко  Е.В.,  Хабаров  А.А.  Цинк  и  питание.  Германия:  LAP  Lambert  Academic  Publishing,  2014.  –  72  с.
2. Будко  Е.В.,  Хабаров  А.А.,  Конопля  А.И.,  Горбачева  Л.А.,  Ельцова  Н.О.  Обогащение  дрожжей  солями  цинка  //  Научные  ведомости.  БелГУ.  Серия  Медицина,  Фармация.  –  2012.  –  №  10.  –  С.  90–94.
3. Распопов  Р.В.  Бузулуков  Ю.П.,  Марченков  Н.С.,  Соловьев  В.Ю.,  Демин  В.Ф.,  Калистратова  В.С.,  Гмошинский  И.В.,  Хотимченко  С.А.  Биодоступность  наночастиц  оксида  цинка.  Изучение  методом  радиоактивных  индикаторов  //  Вопросы  питания.  –  2010.  –  №  6.  –  С.  14–16.
4. Хабаров  А.А.,  Будко  Е.В.,  Жилякова  Е.Т.,  Новиков  О.О.,  Новикова  М.Ю.,  Попов  Н.Н.,  Ванхин  О.А.  Изучение  изменения  технологических  характеристик  порошка  цинка  оксида  в  процессе  его  твердофазной  механохимической  обработки  //  Научные  ведомости  БелГУ.  Серия  Медицина,  Фармация.  –  2012.  –  №  22.  –  С.  116–120.
5. Brunner  T.J.,  Wick  P.,  Spohn  P.  In  vitro  cytotoxicity  of  oxide  nanoparticles:  comparison  to  asbestos,  silica,  and  the  effect  of  particle  solubility.  //  Environ.  Sci.  Technol.  –  2006.  –  №  40.  –  PP.  4374–4381.
6. Maret  W.  Zinc  biochemistry:  from  a  single  zinc  enzyme  to  a  key  element  of  life.  //  Advances  in  nutrition.  –  2013.  –  №  4.  –  P.  82–91.
7. Saravanan  V.S.,  Kalaiarasan  P.,  Madhaiyan  M.,  Thangaraju  M.  Solubilization  of  insoluble  zinc  compounds  by  Glyconobacter  diazotrophicus  and  the  trimental  action  of  zinc  ion  (Zn2+)  and  zinc  chelates  on  root  knot  nematode  Meloidogyne  incognita.  //  Letters  in  applied  microbiology.  –  2007.  –  №  44.  –  P.  235–241.