Телефон: +7 (383)-202-16-86

Статья опубликована в рамках: XXXVI-XXXVII Международной научно-практической конференции «Естественные и математические науки в современном мире» (Россия, г. Новосибирск, 07 декабря 2015 г.)

Наука: Биология

Секция: Молекулярная биология

Скачать книгу(-и): Сборник статей конференции

Библиографическое описание:
Петрова А.В., Горшков А.Н., Егоров В.В. [и др.] ОЦЕНКА ТРАНСФЕКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНА В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ДОСТАВКИ КОРОТКИХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК // Естественные и математические науки в современном мире: сб. ст. по матер. XXXVI-XXXVII междунар. науч.-практ. конф. № 11-12(35). – Новосибирск: СибАК, 2015.
Проголосовать за статью
Дипломы участников
У данной статьи нет
дипломов


 


ОЦЕНКА  ТРАНСФЕКЦИОННОЙ  СПОСОБНОСТИ  ПРОИЗВОДНЫХ  ХИТОЗАНА  В  КАЧЕСТВЕ  НОСИТЕЛЕЙ  ДЛЯ  ДОСТАВКИ  КОРОТКИХ  ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ  РНК


Петрова  Александра  Валерьевна


м.н.с.  «НИИ  Гриппа»  Минздрава  России, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург,


аспирант  ИФНИТ,  СПбПУ  им.  Петра  Великого, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург,


E-mail: 


Горшков  Андрей  Николаевич


канд.  биол.  наук,  с.н.с.  «НИИ  Гриппа»  Минздрава  России, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург,


E-mail


Егоров  Владимир  Валерьевич


канд.  биол.  наук,  в.н.с.  «НИИ  Гриппа»  Минздрава  России, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург,


E-mail


Бондаренко  Андрей  Борисович


биологический  факультет,  СПбГУ,  РФ,  г.  Санкт-Петербург,


лаб.иссл.  «НИИ  Гриппа»  Минздрава  России, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург


E-mail


Шурыгина  Анна-Полина  Сергеевна


канд.  биол.  наук,  c.н.с.  «НИИ  Гриппа»  Минздрава  России, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург,


E-mail


Грудинина  Наталья  Андреевна


канд.  биол.  наук,  с.н.с.,  ФГБНУ  «ИЭМ»,
  РФ,  г.  Санкт-Петербург,


Васин  Андрей  Владимирович


канд.  биол.  наук,  зав.лаб.  структурной  и  функциональной  протеомики


«НИИ  Гриппа»  Минздрава  России,  РФ,  г.  Санкт-Петербург,


доцент,  ИФНИТ,  СПбПУ  им.  Петра  Великого, 
РФ,  г.  Санкт-Петербург,


E-mail: 


 


CHITOSAN  DERIVATIVES,  AS  CARRIERS  FOR  SYNTHETIC  SHORT  INTERFERING  RNA  CELL  DELIVERY


Alexandra  Petrova


junior  researcher  "Influenza  Research  Institute"  Russian  Health  Ministry,  Russian  Federation,  Saint-Petersburg,


IFNIT  graduate  student,  Peter  the  Great  Polytechnic  University,


Russia,  Saint-Petersburg


Andrei  Gorshkov


PhD,  senior  researcher  "Influenza  Research  Institute"  Russian  Health  Ministry,


Russia,  St.  Petersburg,


Vladimir  Egorov


PhD,  leading  researcher  "Influenza  Research  Institute"  Russian  Health  Ministry,


Russia,  St.  Petersburg,


Andrey  Bondarenko


Department  of  Biology,  St.  Petersburg  State  University,


Russian  Federation,  St.  Petersburg,


Lab  assistant,  "Influenza  Research  Institute"  Russian  Health  Ministry, 
Russia,  Saint-Petersburg


Anna-Polina  Shurygina,


PhD,  senior  researcher,  "Influenza  Research  Institute"  Russian  Health  Ministry,


Russia,  St.  Petersburg,


Grudinina  Natalya


PhD,  senior  researcher,  “Institute  of  Experimental  Medicine”, 
Russia,  St.  Petersburg


Andrei  Vasin,


PhD,  head  of  the  laboratory  of  structural  and  functional  proteomics


"Influenza  Research  Institute"  Russian  Health  Ministry,


Russian  Federation,  St.  Petersburg,


Associate  Professor,  IFNIT,  Peter  the  Great  Polytechnic  University,


RussiaStPetersburg.


 


Данная  работа  выполнена  при  финансовой  поддержке  РНФ  (грант  №  15-15-00170  «Клеточные  микроРНК  –  новые  молекулярные  мишени  для  терапии  тяжелых  вирусных  инфекций».


 


АННОТАЦИЯ


В  данной  работе  были  изучены  свойства  коммерческих  и  синтетических  производных  хитозана  при  их  использовании  в  качестве  поликатионных  носителей  для  доставки  коротких  интерферирующих  РНК  (киРНК)  в  клетки  MDCK  и  HEK293.  Была  оценена  способность  носителей  к  образованию  стабильных  комплексов  с  киРНК,  а  также  токсичность  ряда  коммерческих  производных  хитозана  –  хитозан  метилгликоля  MGly,  хитозан  гидрохлорида  HCl,  хитозан  олиголактата  OL  (Sigma),  а  также  модифицированного  хитозана  Q-348,  обогащённого  четвертичными  аминогруппами,  синтезированного  в  НИИ  нефтехимического  синтеза  им.  А.В.  Топчиева  РАН.  Ранняя  динамика  проникновения,  скорость  и  эффективность  доставки  киРНК  с  флуоресцентной  меткой  в  клетки  была  показана  различными  методами,  включая  флуоресцентную  и  конфокальную  микроскопию,  а  также  проточную  цитофлуориметрию  для  хитозанов  MGly  и  Q-348.


ANNOTATION


In  this  study  several  commercial  and  synthetic  chitosan  derivatives  were  investigated  as  polycationic  carriers  for  delivery  of  short  interfering  RNAs  (siRNAs)  on  MDCK  and  HEK293  cell  models.  Several  commercial  derivatives  of  chitosan  such  as  chitosan  methylglycol  MGly,  chitosan  hydrochloride  HCl,  chitosan  oligolaktat  OL  (Sigma),  and  one  synthetic  modified  chitosan  Q-348  enriched  quaternary  amine,  which  was  made  in  the  Institute  of  Petrochemical  Synthesis  Topchieva  A.V.  RAS,  were  estimated  to  form  stable  polyplexes  with  siRNA.  For  all  of  them  the  toxicity  was  estimated  as  well.  The  early  dynamics,  efficiency  and  speed  of  fluorescently  labeled  siRNA  delivery  was  shown  and  determine  by  different  methods  including  fluorescent  and  confocal  microscopy  and  cytofluorometry  for  only  two  chitosan  MGly  and  chitosan  Q-348.


 


Ключевые  слова:  киРНК;  поликатионные  носители;  хитозан;  флуоресценция;  эндосомальная  доставка.


Key  words:  siRNA;  polycations;  chitosan;  fluorescence;  endosomal  escape.


 


РНК-интерференция  –  это  молекулярный  механизм  регуляции  экспрессии  генов,  опосредованный  комплементарным  взаимодействием  коротких  двунитевых  РНК  с  мРНК  гена  мишени,  с  последующей  остановкой  транскрипции  при  помощи  белкового  комплекса  RISC.  Этот  процесс  с  участием  эндогенных  малых  РНК  происходит  конститутивно  в  любых  эукариотических  клетках.  А  также  было  показано,  что  синтетические  короткие  интерферирующие  РНК  (киРНК),  введенные  в  клетку,  распознаются  RISC  и  могут  блокировать  мРНК,  препятствуя  трансляции  белков  [1].


В  последние  годы  интенсивно  изучается  подход,  основанный  на  целенаправленном  введении  киРНК  в  качестве  лекарственного  препарата,  против  многих  острых  респираторных  инфекций,  включая  грипп  [2].  Такой  подход  является  перспективным  вследствие  высокой  специфичности  киРНК,  отсутствием  токсичности  у  киРНК  и  возможностью  обойти  резистентность  вируса  к  такому  препарату.  Основной  проблемой  создания  такого  рода  препаратов  является  правильный  выбор  носителя  для  стабильной  и  эффективной  доставки  киРНК  в  клетку.  В  случае  вируса  гриппа  А  (ВГА)  человека  наиболее  эффективным  должен  быть  носитель,  подходящий  для  интраназального  введения  препарата,  так  как  этот  путь  минимизирует  системную  потерю  киРНК,  доставляя  их  специфически  к  месту  локализации  ВГА-клеткам  верхних  дыхательных  путей.  В  качестве  средства  доставки  часто  используются  поликатионные  полимеры,  способные  связывать  большое  количество  киРНК  за  счет  своих  положительных  зарядов,  а  также  обеспечивающие  защиту  РНК  от  нуклеаз  клетки.  Особо  перспективным  носителем  для  доставки  киРНК  в  клетки  представляется  хитозан  и  его  производные,  так  как  этот  природный  полимер  обладает  низкой  цитотоксичностью,  биодеградируемостью,  хорошей  биосовместимостью.  Хитозан  способен  связывать  нуклеиновые  кислоты  с  образованием  стабильных  комплексов,  размер  которых  составляет  100–200  нм.  Частицы  такого  размера  успешно  эндоцитируются  эпителиальными  клетками.  Эффективность  хитозан-опосредованной  трансфекции  определяется  способностью  комплексов  хитозана  с  киРНК  выходить  из  эндосомального  компартмента  в  цитоплазму  (endosomal  escape),  где  и  осуществляется  киРНК-интерференция.  Молекулярная  основа  endosomal  escape  в  случае  хитозана  детально  не  исследована,  однако  предполагается,  что  разрыв  мембраны  эндосомы  осуществляется  по  механизму  «протонной  губки»,  аналогично  ряду  других  поликатионов  [3].


В  нашей  работе  была  исследована  способность  к  комплексообразованию  с  дц  киРНК  ряда  коммерческих  производных  хитозана:  хитозана  метилгликоля  MGly  (Sigma),  хитозана  гидрохлорида  HCl  (Sigma),  хитозана  олиголактата  OL  (Sigma),  а  также  модифицированного  хитозана  Q-348,  обогащённого  четвертичными  аминогруппами.  Хитозан  Q-348  был  синтезирован  в  НИИ  нефтехимического  синтеза  им.  А.В.  Топчиева  РАН.  Также  для  всех  производных  хитозана  была  определена  токсичность  на  клеточной  модели  MDCK;  и  оценена  способность  и  динамика  попадания  в  клетку  комплексов  хитозан-киРНК  на  клеточной  модели  MDCK.


В  качестве  модельной  киРНК,  для  решения  задач  визуализации,  мы  использовали  синтетические  дц  киРНК,  содержащие  флуоресцентную  метку  на  3’-  конце.


Для  создания  комплексов  киРНК  с  поликатионами  смешивались  равные  объемы  водных  растворов  киРНК  и  растворов  поликатионов  с  различной  концентрацией,  чтобы  получить  следующие  соотношения  N/P  (азотных  групп  поликатиона  к  фосфатным  группам  РНК,  в  расчёте  на  один  нуклеотид  и  одно  мономерное  звено):  1/32,  1/16,  1/8,  1/4  ,1/2,  1/1,  2/1,  4/1,8/1,  80/1.  Комплексы  эффективно  перемешивались  встряхиванием,  осаждались  с  помощью  микроцентрифугирования  и  инкубировались  при  комнатной  температуре  в  течение  1  часа.  Проверка  связывания  киРНК  с  поликатионом  осуществлялась  методом  электрофоретического  разделения  в  15  %  полиакриламидном  геле  по  гашению  флуоресценции  бромистого  этидия  для  дцРНК,  связанной  в  комплекс  с  поликатионом.  Было  показано,  что  минимальное  соотношение  N/P,  при  котором  экранируется  полностью  дц  киРНК  в  комплексе,  составляет  2/1  для  хитозана  Q-348,  и  4/1  для  хитозана  MGly.  Для  остальных  коммерческих  производных  хитозана  соотношение  N/P  =80/1  оказалось  недостаточным  для  полного  экранирования  киРНК;  и  как  следствие  эти  поликатионы  были  признаны  неэффективными  для  комплексов  с  киРНК.


Токсичность  полученных  растворов  поликатионов  определяли  при  помощи  микротетразолиевого  теста  (МТТ)  после  24  часов  инкубации  клеток  MDCK  с  растворами  поликатионов,  добавленных  в  среду  в  трехкратном  разведении.  Оптическую  плотность  измеряли  в  лунках  планшетов  на  планшетном  ридере  Victor  1420  (Perkin  Elmer,  Финляндия)  на  длине  волны  535  нм.  LD50  для  монослоя  MDCK  в  лунках  96  луночного  планшета  (10клеток)  составила:  188  мкг/мл  для  хитозана  Q-348;  8,2  мг/мл  для  хитозана  MGly;  3,8  мг/мл  хитозана  OL;  6,6  мг/мл  хитозана  HCl.


По  совокупности  данных  анализа  были  отобраны  для  дальнейшей  оценки  доставки  в  клетку  только  хитозан  метилгликоль  и  Q-348,  так  как  способны  образовывать  стабильный  комплекс  с  киРНК  в  концентрациях,  не  токсичных  для  клеток. 


 



Рисунок  1.  Данные  проточной  цитофлуориметрии  для  хитозана  Q-348.  Популяция  клеток  MDCK  содержащая  флуоресцентно-меченную  киРНК,  после  5,  20,  40  и  60  минут  инкубации  клеток  в  среде,  содержащей  комплексы  хитозан-РНК


 


Проникновение  комплекса  хитозан-киРНК  в  клетки  MDCK  оценивалось  по  данным  флуоресцентной  микроскопии  фиксированных  клеток  с  окраской  актина  в  различные  временные  интервалы  после  внесения  комплекса  в  среду  от  1  минуты  до  24  часов.  Было  показано  наличие  и  накопление  комплексов  в  цитоплазме  начиная  с  первой  минуты  эксперимента  и  до  20  минут.  При  помощи  лазерной  проточной  цитофлуориметрии  («BD  FacsCanto2»,  США)  было  показано,  что  93,5+∆1,5  %  клеток  содержат  комплекс  с  флуоресцентной  меткой  после  60  минут  инкубации  клеток  с  комплексами  (рис.1).  Также  было  показано,  что  скорость  накопления  комплексов  в  клетках  не  зависит  от  дозы  киРНК  в  комплексах.  Также  было  подтверждено  накопление  комплексов  хитозан-РНК  с  флуоресцентной  меткой,  начиная  с  первой  минуты  после  внесения,  данными  микроскопии  в  режиме  реального  времени  на  конфокальном  микроскопе  (Carl  Zeiss,  Германия)  на  клеточных  моделях  MDCK  и  HEK249.


 

Список  литературы:

  1. Ryther  R.C.C.,  Flynt  A.S.,  Phillips  J.A.,  &  Patton  J.G.  (2005).  siRNA  therapeutics:  big  potential  from  small  RNAs.  Gene  therapy,  12(1),  5–11.
  2. Ge  Q.,  McManus  M.T.,  Nguyen  T.,  Shen  C.H.,  Sharp  P.A.,  Eisen  H.N.,  &  Chen  J.  (2003).  RNA  interference  of  influenza  virus  production  by  directly  targeting  mRNA  for  degradation  and  indirectly  inhibiting  all  viral  RNA  transcription.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,  100(5),  2718–2723.
  3. Richard  I.,  Thibault  M.,  De  Crescenzo  G.,  Buschmann  M.  D.,  &  Lavertu  M.  (2013).  Ionization  behavior  of  chitosan  and  chitosan–DNA  polyplexes  indicate  that  chitosan  has  a  similar  capability  to  induce  a  proton-sponge  effect  as  PEI.  Biomacromolecules,  14(6),  1732–1740.
Проголосовать за статью
Дипломы участников
У данной статьи нет
дипломов

Оставить комментарий