АРГИНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ У ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА ASPERGILLUS NIGER R-3

Оганесян Софик Петросовна

д-р биол. наук, проф. ЕГУ, РА,

Республика Армения, г. Ереван

E-mail: SophikHovhannisyan@yahoo.com

THE ACTIVITY OF ARGINASE IN MOLD FUNGI OF ASPERGILLUS NIGER R-3

Sophik Hovhannisyan

doctor of biological sciences, professor of Yerevan State University,

Armenia, Yerevan

АННОТАЦИЯ

Изучалась активность фермента аргиназы у плеснвого гриба Aspergillus niger-R3. Показано, что при выращивании его на питательной среде, содержащей сульфат аммония, L-аргинин резко стимулирует активность ферментов в присутствии субстрата – L-аргинин. Фермент имеет цитоплазматическую локализацию и обладает субстратной специфичностью.

ABSTRACT

We have studied the arginase enzyme activity of Aspergillus Niger R3. It is shown that when growing it on a nutrient medium containing ammonium sulfate, L-arginine strongly stimulates enzyme activity in the presence of the substrate L-arginine. The enzyme has a cytoplasmic localization and a substrate specificity.

Ключевые слова: аргиназа; пероксисомы; плесни; L-аргинин.

Key words: arginase; peroxisome; fungi; L-arginine.

Содержание аргинина в органах и тканях в основном лимитируется аргиназой, которая расщепляет его на орнитин и мочевину, и представлена двумя формами- цитоплазматической и митохондриальной. Последние работы свидетельствуют об участии этого фермента в механизмах иммуносупрессии и подавлении противоопухолевого ответа [1].

Имеется множество литературных данных о содержании различных изоферментов аргиназы у животных и микроорганизмов. Общеизвестно, что уреотелическая аргиназа в печени млекопитающих участвует в обезвреживании аммиака, а отдельные ферменты орнитинового цикла имеют своё самостоятельное место в метаболизме клетки [3].

Oчевидно, что обнаружение ферментов служит для обеспечения оптимальных концентраций в клетках аргинина, биосинтеза глутамина, обеспечивающего биосинтез важнейших азотсодержащих компонентов клетки (пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, гексозамины, гистидин, триптофан), которые вызывают индукцию белков и, в том числе ферментов.

Относительно существования орнитинового цикла у микроорганизмов в литературе имеются немногочисленные данные, касающиеся N. crassa, Sach. cerevisiae, Bac. Licheniformis, Bac. subtilis и др. [2]. В литературе отсутствуют данные относительно наличия ферментов орнитинового цикла, в особенности, аргиназы у плесневого гриба Aspergilus niger R-3

Целью данной работы является исследование аргиназы у Asp. niger R-3, в частности, выявление ее активности и изучение некоторых регуляторных свойств.

Объект и методы исследования. В качестве объекта исследования служит плесневой гриб Asp. niger R-3, который используется в производстве лимонной кислоты [5], приведенный из института Микробиологии Санкт-Петербурга.

Состав питательной среды роста грибов – гриб выращивали в синтетической среде Ролена, 100 мл которого (рН-7.0) содержат следующие компоненты, растворенные в 100 мл водопроводной воды: глюкоза (Sigma) – 2 г., KH₂PO₄0 (Sigma) – 0.05 г, ZnSo₄x7H₂O (Sigma) – 0.005 г, МgSo₄ (Sigma) – 0.05 г, L–аланин – 0,4 г артинин – 1,1 г, (NH₄)₂ SO₄^-0,35 г (Renal Hungary) в качестве источника азота.

Посев производился в 100 мл среды, в стерильных условиях, при температуре 42^оС, а выращивание – при 32^оС в ультратермостате (УТ-15) в течении 4 дней.

Приготовление плесневого экстракта – 4-х дневную выращенную культуру Asp. niger R-3 обезвоживали на фильтровальной бумаге, взвешивали и подвергали гомогенизации в дистилированной воде в гомогенизаторе типа Поттера-Эльведжема (6 минут), 10 % гомогенат центрифугировали (центрифуга СЛ-1) со скоростью (3000 об\мин) 600–700 g при температуте 0–4^оС 10 минут для удаления ядерной фракции.

Определение аргиназной активности – аргиназную активность определяли методом Ратнера с небольшими изменениями (Rathner et al., 1949). К 1 мл исследуемого экстракта плесневого гриба добавляли 5 мкМ MnCl₂, 0.04 М глицинового буфера (рН-9.5) и 50 мкМ, L – аргинина. После часовой инкубации реакцию остановили добавлением 15 % ТХУ. Спустя 20 минут экстракт подвергли центрифугированию, и в надосадочной жидкости определили мочевину. Активность фермента выражалась в микромолях (мkM) образовавшейся мочевины на 1 г мицелия [4].

Статистическая обработка результатов исследований – осуществляли, применяя метод достоверности Стъюдент-Фишера (Гиурман 1997). Достоверность различий средних (р) величин определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Рокицкий, 1973).

Результаты исследования: В I-ой серии эксперимента исследовали аргиназную активность при росте гриба в синтетической среде с различными источниками азота ((NH₄)₂SО₄ и L-аргинин). Данные таблицы 1 показывают, что при росте на среде с сульфатом аммония, активность фермента, в среднем, составляет 58,1 мкМ, удельная активность – 2,7 мкМ. А при росте на среде с L-аргинином в качестве источника азота, активность аргиназы резко увеличивается (приблизительно в 3 раза): общая активность равна 189,2 мкМ, а удельная активность – 8,8 мкМ. Эти данные свидетельствуют о субстратной индукции аргиназы. В литературе имеются данные о субстратной индукции аргиназы у ряда микроорганизмов: дрожжи рода Candida, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus vidulans [2].

Таблица 1.

Аргиназная активность гриба Aspergillus niger при росте на синтетической среде с различными источниками азота

В следующей серии экспериментов исследовалась внутриклеточная локализация аргиназы. Известно, что локализованные в цитоплазме некоторые растворимые ферменты могут находиться в определенных внутриклеточных структурах, каковыми могут быть различные популяции пероксисом, в которых находятся D- и L-аминокислотные оксидазы, каталаза, уратоксидаза и др. [6].

Методом изопикнического центрифугирования в градиенте 0,25 М сахарозы и 15 % перколла из гомогената плесневого гриба Aspergillus niger R-3 были выделены 4 пероксисомальные фракции, в которых была определена аргиназная активность. Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что активность аргиназы локализована в основном в III-ей и IV-ой фракциях пероксисом. Далее исследовалось влияние некоторых аминокислот (L-орнитин, L-лизин, L-пролин) на активность аргиназы Aspergillus niger R-3. Литературные данные относительно влияния этих аминокислот у различных организмов несколько противоречивы. Так L-орнитин не влияет на аргиназную активность Bacillus subtilis, а у аэробных инфузорий высокомолекулярный изоэнзим аргиназы ингибируется L-орнитином и L-пролином, но не L-лизином. L-орнитин является конкурентным ингибитором аргиназы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и грибов Neurospora crassa.

Таблица 2.

Аргиназная активность гриба Aspergillus niger в различных пероксисомальных фракциях

Таблица 3.

Влияние аминокислот на аргиназную активность гриба Aspergillus niger R-3

Данные таблицы 3 показывают, что все исследуемые аминокислоты (50 мкн) имеют ингибирующее влияние на аргиназную активность как в общем гомогенате, так и в отдельных пероксисомальных фракциях. Наивысшее ингибирующее влияние оказывает L-орнитин (76 %), чуть слабее – L-лизин (60 %). Сравнительно слабое ингибирующее влияние оказывает L-пролин (27 %). Этот факт представляет некоторый интерес, свидетельствуя о том, что, аргиназа плесневого гриба Aspergillus niger R-3 является неуреотелической и может функционировать в системе биосинтеза пролина и аргинина.

Развивается точка зрения о том, что в зависимости от состава питательной среды образуются различные популяции пероксисом с различными наборами окислительных ферментов, обеспечивающих адаптацию гриба к условиям внешней среды.

Кроме того, плесневая аргиназа является регулируемым ферментом и педвергается субстратной индукции.

Список литературы:

1. Авакян О.Х. – Антиоксидазная активность E. coli и метаболический профиль L-аргинина и креатина при асцитной карциноме Эрлиха, автореф. – Ереван, Армения 2015.
2. Габриелян Г.А. – Ферменты орнитинового цикла у дрожжей С. guilliermondii ВКМ-У-42, автореф. – Ереван, Армения.
3. Давтян М.А. – Эволюционные аспекты образования и нейтрализации аммиака. III Сисакяновские чтения – Ереван, Армения 2004 – С. 106–155.
4. Давтян Р.М., Оганесян С.П. и др. – Влияние перекиси водорода на активность ферментов орнитинового цикла у плесневого гриба Asp.niger R-3 – Биолог.журнал Армении LXV3,2013 – С. 46–50.
5. Журавский Г.И. и др. – Производство пищевых кислот. – М,1953, С. 1–234.
6. Baudhuin P. – Liver peroxisomes, citozoly and function. Ann NY Acad – Sci168, 1969 – Р. 209–381.