СРАВНИТЕЛЬНОЕ  ИССЛЕДОВАНИЕ  ЭФФЕКТИВНОСТИ  РАЗЛИЧНЫХ  СОРБЕНТОВ  ДЛЯ  ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО  ВЫДЕЛЕНИЯ  И  ОЧИСТКИ  ЛИЗОЦИМА

Карнаухова  Ирина  Владимировна

канд.  биол.  наук,  доцент  ОГПУ,  РФ,  г.  Оренбург

Шукшина  Светлана  Сергеевна

канд.  биол.  наук,  доцент  ОГПУ,  РФ,  г.  Оренбург

E-mail: 

Урманцева  Альмира  Нажиловна

студент  5  курса  факультета  «Институт  естествознания  и  экономики»,  ФГБОУ  ВПО  Оренбургский  государственный  педагогический  университет,  РФ,  г.  Оренбург

E-mail: 

COMPARATIVE  EFFECTIVENESS  RESEARCH  OF  VARIOUS  SORBING  AGENTS  FOR  CHROMATOGRAPHICAL  DISENGAGEMENT  AND  PURIFICATION  OF  LYSOZYME

Karnauhova  Irina

candidate  of  biological  sciences,  associate  professor  of  Orenburg  State  Pedagogical  University,  Russia,  Orenburg

Shukshina  Svetlana

candidate  of  biological  sciences,  associate  professor  of  Orenburg  State  Pedagogical  University,  Russia,  Orenburg

Urmantseva  Almira

student  5  courses  of  the  faculty  of  Science  and  Institute  of  Economics  Orenburg  State  Pedagogical  University,  Russia,  Orenburg

АННОТАЦИЯ

Работа  была  проведена  с  целью  выявления  более  эффективного  метода  выделения  и  очистки  лизоцима.  Сравнение  эффективности  аффинной  и  катионообменной  хроматографии  осуществляли  по  следующим  показателям:  степень  очистки,  количество  выделенного  фермента,  степень  загрязненности  солями.  Метод  хроматографии  на  хитине  по  сравнению  с  хроматографией  на  карбоксиметилцеллюлозе  является  более  дешевым,  позволяет  получить  большее  количество  фермента,  при  этом  фермент  получается  незагрязненным  солями.

ABSTRACT

The  work  is  made  in  order  to  identify  a  more  effective  method  for  disengagement  and  purification  of  lysozyme.  Comparison  of  effectiveness  of  affine  and  cation  exchange  chromatography  is  performed  according  to  the  following  parameters:  the  degree  of  purification,  the  number  of  isolated  enzyme,  the  degree  of  salt  contamination.  Chromatography  method  based  on  chitin  is  cheaper  in  comparison  with  chromatography  based  on  carboxymethyl  cellulose  that  allows  resuming  a  larger  amount  of  enzyme,  wherein  the  enzyme  is  obtained  by  uncontaminated  salts.

Ключевые  слова:  лизоцим;  хитин;  карбоксиметилцеллюлоза.

Keywords :  lysozyme;  chitin;  carboxymethyl.

Лизоцим  является  первым  барьерным  ферментом  для  бактерий,  попадающих  из  окружающей  среды  различными  путями  в  любой  живой  организм,  в  том  числе  и  в  организм  двустворчатых  моллюсков,  являющихся  фильтраторами  придонных  слоев  воды  в  водоемах  [1,  с.  58].

Бактерии,  попадающие  в  мантийную  полость  моллюсков  должны  своевременно  элюминироваться.  В  случае  если  этого  не  происходит,  снижается  жизнеспособность  двустворчатых  моллюсков  вследствие  снижения  лизоцимной  активности.  Такова  же  роль  данного  фермента  и  в  организме  человека.  Лизоцим  в  разных  концентрациях  обнаружен  в  селезенке,  сердце,  печени,  легком,  в  различных  секреторных  выделениях  (слезы,  слизь  носа,  слюна),  в  белке  яйца,  в  соках  некоторых  растений,  у  микроорганизмов  и  бактериофагов  [2,  с.  35].

В  настоящее  время  известно  множество  медицинских  препаратов,  действующим  веществом  которых  является  лизоцим.  К  таковым  относятся,  например,  гексализ,  бифилиз,  лизобакт.

Для  выделения  данного  фермента  в  чистом  виде  активно  применяют  жидкостную  ионно-обменную  хроматографию.  Из  литературных  данных  известно  о  выделении  лизоцима  и  последующей  его  очистки  из  разных  биологических  объектов  (растений,  бактерий,  насекомых,  грибов).  Исторически  более  ранним  методом  является  сорбция  и  последующая  очистка  лизоцима  на  хитине.  Специфическая  сорбция  на  хитине  является  эффективным  методом  очистки  данного  фермента  [4,  с.  114].  Также  из  литературы  известно  о  способе  выделения  лизоцима  на  карбоксиметилцеллюлозе,  которая  является  более  эффективным  сорбентом  по  сравнению  с  другими  (агароза,  декстранты)  при  катионообменной  хроматографии  [6,  с.  652].

В  связи  с  вышеприведенными  данными  представилось  актуальным  провести  сравнительный  анализ  эффективности  аффинной  хроматографии  на  хитине  и  ионообменной  хроматографии  на  карбоксиметилцеллюлозе  для  очистки  лизоцима  двустворчатых  моллюсков  Unio  pictorum.

Материалы  и  методы  исследования

Материалом  для  исследования  послужили  ткани  U.  pictorum,  полученные  при  растирании  на  холоду  с  кварцевым  песком  в  0,1  М  фосфатном  буферном  растворе  (рН  6,2)  [5,  с.  42]. 

Для  хроматографии  использовали  колонку  (2,0×20  см),  заполненную  в  случае  катионообменной  хроматографии  карбоксиметилцеллюлозой,  уравновешенную  0,1  М  ацето-аммонийным  буфером  (рН  5,0),  а  в  случае  аффинной  хроматографии  —  хитиновым  сорбентом,  суспензированным  в  0,1  М  фосфатном  буфере  (рН  8,5).  При  хроматографии  на  карбоксиметилцеллюлозе  лизоцим  десорбировали  0,8М  ацетатом  аммония  (рН  4,5).  Собирали  фракции  объемом  по  2  мл  (20  фракций).  Во  всех  фракциях  определяли  содержание  белка  [5,  c.  43].  При  хроматографии  на  хитине  колонку  промывали  тем  же  буфером  объемом  200  мл,  а  затем  дистиллированной  водой.  Лизоцим  элюировали  5  %-ной  уксусной  кислотой.  Собирали  фракции  объемом  5  мл.  Во  всех  фракциях  определяли  содержание  белка  [4,  c.  52]. 

Содержание  белка  в  экстрактах  определяли  по  методу  Брэдфорда.  В  элюатах  содержание  белка  определяли  спектрофотометрическим  методом  по  Варбургу  и  Кристиану  на  цифровом  СФ  PD  —  303  UV.

Исследуемые  пробы  фотометрировали  при  260  и  280  нм.  Расчет  концентрации  белка  (мг/мл)  производили  по  формуле  [3,  с.  362]: 

C_белка  =  1,55D₂₈₀  –  0,76D₂₆₀,

где  D₂₈₀  —  оптическая  плотность  при  280  нм;

D₂₆₀  —  оптическая  плотность  при  260  нм.

Результаты  и  их  обсуждение

Проводимые  опыты  показали  хорошую  воспроизводимость  методов.  Белок  постоянно  выходил  одним  пиком  и  на  хитине  —  фракции  8—12(рис.  1.а.),  и  на  карбоксиметилцеллюлозе  —  фракции  8—10  (рис.  1.б.).  В  этих  же  фракциях  была  локализована  лизоцимная  активность. 

На  рисунке  1  отражены  результаты  хроматографии  супернатанта  тканей  U.  рictorum. 

Рисунок  1.  Выделение  лизоцима  моллюсков  U .  pictorum  на  колонке  с  хитином  (а)  и  на  колонке  с  карбоксиметилцеллюлозой  (б)

Поскольку  карбоксиметилцеллюлоза  обратимо  связывается  только  с  лизоцимом  —  проявляется  четкая  специфичность  данного  соединения  к  анализируемому  ферменту,  следовательно,  можно  предположить,  что  в  полученных  фракциях  содержится  достаточно  очищенный  лизоцим.  Максимальное  содержание  белка  отмечено  во  фракциях  №  8—№  10,  которое  в  среднем  составляет  1200  мкг/мл.  Учитывая,  что  содержание  общего  белка  в  экстрактах  тканей  моллюсков  до  очистки  составляет  12000  мкг/мл,  при  использовании  ионообменной  хроматографии  был  получен  препарат,  очищенный  в  10  раз. 

При  хроматографии  на  хитине  максимальная  концентрация  белка  была  отмечена  во  фракциях  №  8—№  12,  которая  в  среднем  составляет  1000  мкг/мл.  Таким  образом,  с  помощью  аффинной  хроматографии  был  получен  препарат,  очищенный  в  12  раз.

Метод  аффинной  хроматографии  позволяет  более  полно  выделить  лизоцим  из  экстрактов  двустворчатого  моллюска  U.  pictorum,  по  сравнению  с  методом  ионообменной  хроматографии.  При  хроматографии  на  карбоксиметилцеллюлозе  белок  более  концентрированный  (200  мкг/мл),  активность  локализована  в  6  мл.  При  хроматографии  на  хитине  получаются  менее  концентрированные  препараты  (30—40  мкг/мл),  активность  локализована  в  25  мл.

Выделение  и  очистка  фермента  методом  хроматографии  на  карбоксиметилцеллюлозе  предполагает  присутствие  солей  в  элюатах,  что  не  наблюдается  при  хроматографии  на  хитине.  Следовательно,  для  выделения  лизоцима  моллюсков  из  данных  сорбентов  наиболее  подходящим  является  хитин,  т.к.  лизоцим  моллюсков  чувствителен  к  ионной  силе  раствора.

Выводы  

Метод  хроматографии  на  хитине  по  сравнению  с  хроматографией  на  карбоксиметилцеллюлозе  является  более  дешевым,  позволяет  получить  большее  количество  фермента,  при  этом  фермент  получается  незагрязненным  солями. 

Список  литературы:

1.Алехина  Г.П.,  Мисетов  И.А.  Влияние  поллютантов  различной  химической  природы  на  микрофлору  внутренних  органов  двустворчатого  моллюска  Unio  pictorum  //  Вестник  ОГУ.  —  №  10(146).  —  2012.  —  с.  58—60.

2.Бухарин  О.В.,  Васильев  Н.В.  Лизоцим  и  его  роль  в  биологии  и  медицине.  Томск:  ТГУ,  1991.  —  208  с.

3.Герхардт  Ф.  Методы  общей  бактериологии:  в  3-х  т.  М.:  Мир,  —  1984.  —  Т.  2.  —  472  с. 

4.Карнаухова  И.В.  Лизоцимный  фактор  пресноводного  двустворчатого  моллюска  Unio  pictorum:  выделение,  характеристика,  функции:  дис.  …  канд.  биол.  наук.  Пермь,  2000.  —  110  с.

5.Минакова  В.В.  Двустворчатые  моллюски  родов  Unio  и  Anadonta  —  компоненты  биологических  ресурсов  р.  Урал  и  участие  их  лизоцима  в  процессах  регуляции  бактериоценозов:  автореф.  дис.  Оренбург,  2005.  —  169  с.

6.Bachali  S.,  Jager  M.,  Jolles  P.  Philogenetic  analysis  of  invertebrate  lysozymes  and  the  evolution  of  lysozyme  function  //  J.  Mol.  Evol.,  —  2002.  —  v.  54.  —  р.  652—664.