ПАТОЛОГИИ  МЕЙОЗА  КЛЕТОК  СЕМЕННИКОВ  БЕЛЫХ  МЫШЕЙ  ПОД  ВОЗДЕЙСТВИЕМ  СОМАТИЧЕСКОГО  АНТИГЕНА  DIROFILARIA   IMMITIS

Согрина  Анастасия  Викторовна

аспирант  ФГБНУ  ВНИИП  им.  К.И.  Скрябина,  РФ,  г.  Москва

E -mail:  sograv@yandex.ru

Бережко  Вера  Кузьминична

д-р  биол.  наук,  профессор,  зав.  лаборатории  иммунодиагностики  и  клеточной  технологии  ФГБНУ  ВНИИП  им.  К.И.  Скрябина,  РФ,  г.  Москва

E -mail:  vog@vniigis.ru

Сивкова  Татьяна  Николаевна

д-р  биол.наук,  профессор  ФГБОУ  ВПО  Пермская  ГСХА,  РФ,  г.  Пермь

E -mail:  tatiana-sivkova@yandex.ru

Написанова  Людмила  Александровна

канд.  биол.наук,  старший  научный  сотрудник  ФГБНУ  ВНИИП  им.  К. И.  Скрябина,  РФ,  г.  Москва

MEIOTIC  DIVISION  PATHOLOGY  IN  LABORATORY  MICE  TESTES  AFTER  DIROFILARIA  IMMITIS  SOMATIC  ANTIGEN  INJECTION

Anastasia  Sogrina

postgraduate  student,  All  Russian  Institute  of  parasitology,  Russia,  Moscow

Vera  Beregko

doctor  of  Biological  Science,  professor,  All  Russian  Institute  of  parasitology,  Russia,  Moscow

Tatyana  Sivkova

doctor  of  Biological  Science,  professor,  Perm  State  Agricultural  Academy,  Russia,  Perm

Lyudmila  Napisanova

candidate  of  Biological  Science,  All  Russian  Institute  of  parasitology,  Russia,  Moscow

АННОТАЦИЯ

Проведена  работа  по  изучению  кариопатического  воздействия  соматического  экстракта  половозрелых  дирофилярий  на  сперматогенный  эпителий  нелинейных  белых  мышей  после  однократного  внутрибрюшинного  введения.  Установлено,  что  антиген  оказывает  на  клетки  выраженное  кариопатическое  и  цитотоксическое  действие,  а  также  угнетает  активность  деления  сперматоцитов. 

ABSTRACT

Investigation  of  karyopatic  effect  of  Dirofilaria  immitis  extract  after  single  intraperitoneal  injection  to  laboratory  mice  was  carried.  Distinct  pathologic  effect  to  nuclei  and  cells  was  observed.  Somatic  extract  reduces  meiotic  division  activity. 

Ключевые  слова:   семенники;  дирофилярия;  кариопатология.

Keywords:   testes;  Dirofilaria;  karyopatology.

Введение .  Влияние  гельминтов  на  организм  хозяина  остается  актуальным  вопросом  современной  паразитологии.  Установлено,  что  гельминты  вызывают  патологические  изменения  ядерных  структур  клеток  человека  и  животных  [3].  Патологии  митоза  и  мейоза  зачастую  приводят  к  возникновению  клеток  с  несбалансированными  кариотипами,  анэуплодии.  Также  в  результате  развития  отдельных  форм  патологий  наблюдаются  хромосомные  аберрации. 

Незавершенные  митозы,  прекращающиеся  по  причине  дезорганизации  или  разрушения  митотического  аппарата,  приводят  к  образованию  полиплоидных  клеток.  Полиплодия  и  формирование  дву-  и  многоядерных  клеток  возникают  в  случае  нарушений  механизмов  цитокинеза.  При  значительных  последствиях  патологии  митоза  возможна  гибель  клетки  [1],  [4].  Известно,  что  практически  любые  патологические  агенты  биологической  природы  —  вирусы,  бактерии,  простейшие  и  гельминты  —  способны  вызывать  поражения  цитогенетических  структур  клеток  человека  и  животных.  Цитогенетические  нарушения,  в  большинстве  случаев,  напоминают  изменения,  индуцируемые  хорошо  известными  мутагенами  —  радиацией  и  химическими  веществами  [3].  По  данным  ученых  соматические  и  метаболические  продукты  многих  гельминтов  являются  митотическими  ядами,  оказывающими  влияние  на  клетки  красного  костного  мозга  и  сперматогенез  [2]. 

В  связи  с  широким  распространением  во  всем  мире  опасного  зооноза,  вызванного  нематодой  Dirofilaria  immitis  (Leidy,  1856)  Railliet  et  Henry,  1911,  а  также  недостаточной  изученностью  вопроса  патогенеза  данного  заболевания  целью  нашей  работы  стало  проведение  оценки  степени  кариопатических  и  цитотоксических  эффектов  белкового  экстракта  половозрелых  дирофилярий  на  процесс  деления  клеток  семенников  белых  мышей.

Материалы  и  методы.   Материалом  для  проведения  исследования  послужили  нелинейные  белые  мыши  —  самцы  массой  18—22  г,  которым  проводили  однократное  внутрибрюшинное  введение  соматического  экстракта  D.  immitis  в  дозе  100  мкг. 

Контрольная  группа  оставалась  интактной.  Каждая  группа  состояла  из  6  мышей.  Убой  животных  проводили  через  4;12;24;48;  и  72  часа  после  введения  антигена.  После  вскрытия  выделяли  семенники  и  готовили  мазки  —  отпечатки,  которые  фиксировали  по  Май-Грюнвальду  и  окрашивали  азур  —  эозином  по  Романовскому.  Затем  микроскопировали  и  осуществляли  подсчет  количества  делящихся  клеток,  учитывали  форму,  размеры  и  окраску  ядер.  Анализ  частоты  встречаемости  клеток  с  кариопатическими  нарушениями  и  цитотоксическими  эффектами  проводили  на  отдельно  лежащих  и  распластанных  клетках  с  подсчетом  не  менее  1000  клеток  на  каждом  препарате.  Для  исследования  митотической  активности  клеток  использовали  митотический  индекс  (МИ,%)  —  отношение  числа  делящихся  клеток  к  общему  числу  клеток,  которые  мы  видим  в  препарате  на  данный  момент.  Микроядра  идентифицировали  как  хроматиновые  округлые  тела  с  гладким  непрерывным  краем,  размером  не  более  1/3  ядра,  которые  располагались  отдельно  от  основного  ядра,  не  преломляли  свет,  с  интенсивностью  окрашивания  и  рисунком  хроматина,  как  у  основного  ядра,  и  находились  в  одной  плоскости  с  ядром  [5].  Кроме  того,  учитывали  двуядерные  клетки,  фрагментацию  и  вакуолизацию  ядра,  раннее  (преждевременное)  разделение  хроматид  в  профазе,  патологии  митоза,  связанных  с  повреждением  митотического  аппарата  и  нарушением  цитотомии.  Для  статистической  обработки  результатов  использовали  пакет  программ  STATISTICA  6. 

Результаты  и  обсуждение.  Данные  анализа  частоты  встречаемости  клеток  с  кариопатическими  изменениями  у  мышей,  подвергнутых  воздействию  белкового  антигена  D.  immitis  и  в  контрольной  группе,  приведены  в  таблице. 

Таблица  1. 

Частота  кариопатических  последствий  в  семенниках  белых  мышей,  подвергшихся  воздействию  соматического  антигена  D .  immitis

Активность  деления  клеток  семенников  по  отношению  к  контролю  незначительно  возрастает  через  4  часа  после  начала  эксперимента,  а  затем  показатель  МИ  снижается  и  через  48  часов  достигает  наименьших  значений.  Таким  образом,  мы  наблюдаем  угнетение  пролиферативной  активности  клеток  семенников,  что  наглядно  отображено  на  линейном  графике  (рис.  1).  При  этом  процент  патологий  от  общего  числа  клеток  по  сравнению  с  контролем  аномально  возрастает  к  12  часам  от  начала  эксперимента.  При  сравнении  соотношения  фигур  деления  во  всех  случаях  экспериментальных  групп  профазы  и  метафазы  значительно  преобладали  над  анафазами  и  телофазами  при  общем  снижении  митотической  активности  и  увеличении  числа  патологий,  связанных  с  повреждением  хромосом  и  митотического  аппарата.  Таким  образом,  можно  предполагать  элиминирование  посредством  апоптоза  патологических  клеток,  что  и  вызвало  дисбаланс  соотношения  фигур  деления  в  экспериментальных  группах.  Число  клеток  с  нормальным  ядром  в  контрольной  группе  (фото  1)  в  несколько  раз  больше,  чем  в  группах  экспериментальных  животных.  При  этом  из  наблюдаемых  патологий  деления  ядра  в  контроле  лидирующее  место  занимает  метафаза  с  отставанием  хромосомы  и  анафаза  —  телофаза  с  мостом. 

Рисунок  1.  Линейный  график  активности  деления  клеток  семенников  под  воздействием  соматического  антигена  D .  immitis.  МИ,(%).

Известно,  что  патологические  митозы  в  нормальных  тканях  встречаются  в  2—3  %  клеток  и  менее  [1].  В  экспериментальных  группах  12  и  48  часов  выявлено  наибольшее  количество  патологий  делящихся  клеток,  среди  которых  преобладает  отставание  хромосом  в  метафазе.  Данная  патология  возникает  при  повреждении  хромосом  в  области  кинетохора.  Поврежденные  хромосомы  пассивно  «дрейфуют»  в  цитоплазме  и  в  итоге  либо  разрушаются  и  элиминируются  из  клетки,  либо  случайным  образом  попадают  в  одно  из  дочерних  ядер,  либо  образуют  микроядро  [1],  что  мы  и  выявляли  в  ходе  эксперимента. 

В  сравнении  с  интактной  группой  появляются  такие  патологии  как  преждевременное  расхождение  хроматид  в  профазе,  многополюсный  митоз  (фото  3),  мосты  в  ана-  телофазе.  Выявленные  патологии  напрямую  связаны  с  повреждением  хромосом  и,  как  правило,  приводят  к  генотипической  разнородности  дочерних  клеток,  а  также  нарушают  течение  завершающих  стадий  деления  и  задерживают  цитокинез  [2].  Значительно  возрастает  количество  клеток  с  агглютинацией  хромосом.  Такая  патология  часто  встречается  в  опухолевых  клетках  и  при  воздействии  митотических  ядов.  Набухая,  хромосомы  утрачивают  правильные  очертания  и,  склеиваясь  поверхностями,  образуют  неправильные  комковатые  массы.  Расхождения  хромосом  не  происходит,  и  клетки  часто  гибнут  [1]. 

При  микроскопировании  окрашенных  мазков-отпечатков  нам  неоднократно  встречалась  патология  деления  яра,  которую  мы  идентифицировали,  как  полное  нерасхождение  сестринских  хроматид  и  поскольку  данная  патология  не  описана  в  литературе,  назвали  ее  «Метафаза  с  тенью»  (фото  2).  По  аналогии  с  классификацией  патологий  митоза  по  Алову  И.А.  (1965)  [1]  предполагаем,  что,  также  как  и  нерасхождение  хромосом,  этот  кариопатический  эффект  связан  с  нарушением  кинетохорной  области,  либо  с  частичной  дезорганизацией  хромосомных  нитей  веретена.  В  незначительном  количестве  за  период  исследования  встречались  формы  патологии,  связанные  с  нарушением  цитотомии. 

1.    2.  3.

Фото.  1.  —  Метафаза  без  патологии  2.  —  Метафаза  с  тенью  3.  —  Многополюсное  деление  клетки.  Окраска  азур-эозином.  Увеличение  10Х100

Выводы.   В  ходе  анализа  полученных  результатов  можно  сделать  вывод,  что  соматический  антиген  D.  immitis  оказывает  на  клетки  семенников  белых  нелинейных  мышей  выраженное  кариопатическое  и  цитотоксическое  действие,  а  также  угнетает  активность  деления  сперматоцитов.  Основные  патологии  связаны  с  повреждением  хромосом  и  аппарата  деления.  Пик  патогенетической  активности  данного  антигена  приходится  на  12  часов  от  начала  эксперимента,  а  через  48  часов  мы  наблюдали  значительное  торможение  процесса  деления  клеток  семенников.  Такой  временной  интервал  можно  объяснить  активацией  контроля  цитогенетического  постоянства  и  сложной  белковой  структурой  соматического  экстракта  гельминта. 

Список  литературы:

1.Алов  И.А.  Цитофизиология  и  патология  митоза  М.:  «Медицина»,  1972.  —  264  с.  —  3700  экз.

2.Кариопатическое  и  патоморфологическое  действие  продуктов  метаболизма  паразитов  и  влияние  на  репродуктивную  функцию  домашних  плотоядных.  Диссертация  и  автореферат  по  ВАК  03.02.11,  д.б.н  Сивкова  Т.Н.  Научная  библиотека  диссертаций  и  авторефератов  disserCat.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.dissercat.com/content/kariopaticheskie-i-patomorfologicheskie-izmeneniya-pod-deistviem-produktov-metabolizma-paraz#ixzz3Lue7lD4b

3.Цитогенетический  анализ  последствий  инфекционного  мутагенеза  в  связи  с  состоянием  иммунореактивности  организма.  Диссертация  по  ВАК  03.00.15,  д.б.н,  Ильинских  Н.Н.  Научная  библиотека  диссертаций  и  авторефератов  disserCat.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.dissercat.com/content/tsitogeneticheskii-analiz-posledstvii-infektsionnogo-mutageneza-v-svyazi-s-sostoyaniem-immun#ixzz3LuKfOx7K

4.Morgan  D.  O.  The  cell:  principles  of  control.  New  science  press,  2007.  —  297  p.  —  ISBN  978-0-9539181-2-6. 

5.Tolbert  P.E.  Micronuclei  and  other  nuclear  anomalies  in  buccal  smears:  methods  development  /  P.E.  Tolbert,  C.M.  Shy,  J.W.  Allen  //  Mut.  Res.  1992.  271.  —  P.  69—77.