ИЗУЧЕНИЕ  КУЛЬТУРАЛЬНЫХ  СВОЙСТВ  УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ  ПЛОТНОЙ  ПИТАТЕЛЬНОЙ  СРЕДЫ  ДЛЯ  ВЫДЕЛЕНИЯ  МИКОБАКТЕРИЙ

Жабина  Виктория  Юрьевна

ассистент  кафедры  инфекционной  и  инвазионной  патологии  ФГБОУ  ВО  «Белгородский  государственный  аграрный  университет  имени  В.Я.  Горина»,  РФ,  г.  Белгород

E-mail:  vika_zhabina@mail.ru

Коваленко  Анатолий  Михайлович

д-р  ветер.  наук,  профессор  кафедры  инфекционной  и  инвазионной  патологии  ФГБОУ  ВО  «Белгородский  государственный  аграрный  университет  имени  В.Я.  Горина»,  РФ,  г.  Белгород

E-mail: 

THE  STUDY  OF  CULTURAL  PROPERTIES  OF  IMPROVED  SOLID  MEDIUM  FOR  MYCOBACTERIA  DISCHARGING

Victoria  Zhabina

assistant  of  Infectious  and  Invasive  Pathology  Chair,  Federal  State  Budgetary  Educational  Institution  of  Higher  Professional  Education  “Belgorod  State  Agrarian  University  named  after  V.Ya.  Gorin”,  Russia,  Belgorod

Anatoliy  Kovalenko

doctor  of  Veterinary  Sciences,  Professor  of  Infectious  and  Invasive  Pathology  Chair,  Federal  State  Budgetary  Educational  Institution  of  Higher  Professional  Education  “Belgorod  State  Agrarian  University  named  after  V.Ya.  Gorin”,  Russia,  Belgorod

АННОТАЦИЯ

Разработана  усовершенствованная  плотная  питательная  среда,  которая  позволяет  ускорить  процесс  получения  первичных  культур  микобактерий  на  3  ±  0,2  суток,  что  существенно  сокращает  сроки  выявляемости  микобактерий  и  дает  возможность  усовершенствовать  культуральные  исследования  в  общей  схеме  бактериологических  исследований  при  туберкулезе  крупного  рогатого  скота. 

ABSTRACT

The  advanced  solid  medium  which  allows  to  speed  up  the  process  of  obtaining  primary  cultures  of  mycobacteria  for  3  ±  0,2  days  is  developed  that  significantly  reduces  the  time  of  mycobacteria  detection  and  provides  an  opportunity  to  improve  cultural  research  in  the  general  scheme  of  bacteriological  studies  of  tuberculosis  of  cattle.

Ключевые  слова:  микобактерии  туберкулеза;  питательная  среда  выделения  микобактерий;  рост  культур;  крупный  рогатый  скот;  патологоанатомические  изменения.

Keywords:  tuberculosis  mycobacteria;  solid  medium  of  mycobacteria  discharging;  cultural  growth;  cattle;  pathologic  anatomic  changes. 

Культуральные  исследования  базируются  на  способности  микобактерий  расти  на  различных  питательных  средах.  Метод  позволяет  получать  изоляты  микобактерий  для  дальнейшей  их  идентификации  и  изучения  их  фенотипических  и  молекулярно-генетическом  особенностей.  Патогенные  микобактерии  в  большинстве  своем  содержат  мало  ферментов  и  веществ,  стимулирующих  их  рост,  и  требуют  обогащения  питательных  сред  [5;  6]. 

Поскольку  в  микобактериях  обменные  процессы  протекают  очень  медленно,  что  сопровождается  их  медленным  ростом  на  питательных  средах,  то  существуют  определенные  сложности  при  использовании  культурального  метода.  По  данным  В.И.  Голышевской  [2],  критерием  чувствительности  данного  метода  является  присутствие  в  1  мл  от  20  до  100  микобактерий.  Ранее  А.П.  Аликаевой  [1]  и  А.И.  Кузиным  [4]  было  предложено  для  обработки  биоматериала  перед  его  посевом  использовать  2—4  %  или  8—10  %  растворы  серной  кислоты.  Но  позднее  А.М.  Кадочкиным  [3]  было  предложено  эффективное  использование  серной,  соляной  и  щавелевой  кислот.

Таким  образом,  существует  необходимость  совершенствования,  как  предпосевной  обработки,  так  и  существующих  питательных  сред  для  первичного  выделения  микобактерий.

Цель  исследований  —  разработка  и  апробация  плотной  питательной  среды  для  выявления  микобактерий  на  основе  агар-агара. 

Материалы  и  методы.  Подбор  питательной  плотной  синтетической  среды  для  выделения  микобактерий  проводили,  основываясь  на  данных  по  химическому  составу  микобактерий.  В  лабораторной  практике  и  на  предприятиях  биологической  промышленности  применяют  различные  питательные  среды.  Недостатком  питательной  среды  Левенштейна-Йенсена  является  постоянный,  но  незначительный  рост  микобактерий,  который  проявляется  лишь  при  наличии  в  1  см³  взвеси  микобактерий  не  менее  100-200  микробных  клеток.  Разработанная  нами  питательная  среда  для  быстрого  выявления  микобактерий  содержит  большинство  компонентов,  необходимых  для  их  роста.  В  состав  питательной  среды  входит  лимоннокислый  аммоний,  как  источник  соли  органической  кислоты  и  отличается  от  аналогов  тем,  что  аспарагин  заменен  на  гликокол.  Для  оптимального  роста  первичных  культур  микобактерий  были  предложены  три  варианта  среды,  куда  входили  ингредиенты  по  массе  в  %  от  общей: 

1.  Аммоний  лимоннокислый  —  1,5;  калий  фосфорнокислый  2-х  замещенный  —  2,0;  магний  сернокислый  семиводный  —  0,2;  железо  сернокислое  —  0,1;  сернокислый  цинк  —  0,1;  гликокол  —  2,0;  фумаровая  кислота  —  2,0;  натрий  фосфорнокислый  2-х  замещенный  —  0,5;  хлористый  натрий  —  0,3;  глицерин  —  20,0;  агар-агар  —  23,0;  глицин  1,5;  остальное  вода.

2.  Аммоний  лимоннокислый  —  1,7;  калий  фосфорнокислый  2-х  замещенный  —  2,4;  магний  сернокислый  семиводный  —  0,3;  железо  сернокислое  —  0,15;  сернокислый  цинк  —  0,15;  гликокол  —  2,5;  фумаровая  кислота  —  2,5;  натрий  фосфорнокислый  2-х  замещенный  —  1;  хлористый  натрий  —  0,4;  глицерин  —  22,0;  агар-агар  —  25,0;  глицин  1,8;  остальное  вода.

$13.  Аммоний  лимоннокислый  —  1,3;  калий  фосфорнокислый  2-х  замещенный  —  1,8;  магний  сернокислый  семиводный  —  0,1;  железо  сернокислое  —  0,05;  сернокислый  цинк  —  0,05;  гликокол  —  1;  фумаровая  кислота  —  1,5;  натрий  фосфорнокислый  2-х  замещенный  —  0,3;  хлористый  натрий  —  0,15;  глицерин  —  18,0;  агар-агар  —  21,0;  глицин  1,0;  остальное  вода.

Во  всех  трех  вариантах  кислотность  была  в  пределах  7,2±0,2.  Все  три  варианты  усовершенствованной  плотной  питательной  среды  готовили  по  следующей  схеме.  Навески  лимоннокислого  аммиачного  железа  растворяли  в  горячей  дистиллированной  воде,  подогревая  ее  на  электрической  плитке,  другие  соли  добавляли  в  теплую  дистиллированную  воду  в  указанной  выше  последовательности,  добавляя  глицерин,  а  затем  после  полного  растворения  добавляли  агар-агар.  рH  среды  доводили  до  нужных  параметров  с  использованием  щелочи,  подвергая  раствор  после  этого  автоклавированию  при  температуре  120⁰  С  в  течение  30  минут.  Изучение  ростовых  свойств  усовершенствованных  питательных  сред  проводили  путем  посева  взвеси  микобактерий  туберкулеза  M.  bovis  до  0,5  мл  с  содержанием  до  0,00001  мг/мл  микробных  клеток.  Посевы  на  опытных  и  контрольной  среде  (Левенштейна-Йенсена)  помещали  в  термостат  при  температуре  37±0,5⁰  C.  Вели  учет  роста  культур  каждые  1—2  суток  в  течение  10—30  суток. 

Результаты  исследований.  Результаты  изучения  элективных  свойств  усовершенствованных  плотных  питательных  сред  представлены  в  таблице  1.  Данные  свидетельствуют  о  том,  что  на  первой  среде  рост  культуры  M.  bovis  в  виде  мелких  с  маковое  зерно,  бугорчатых  белого  цвета  колоний  (1—2  образования)  проявился  на  15±  0,3  сутки.  На  второй  —  на  17±0,3,  на  третьей  на  19±0,3  сутки.  На  контрольной  среде  (Левенштейна-Йенсена)  рост  микобактерий  в  виде  единичных  с  маковое  и  просяное  зерно  бугорчатых  образований,  обнаруживался  на  18±  0,2  сутки. 

Таблица  1.

Результаты  сравнительного  изучения  усовершенствованных  плотных  питательных  сред  для  выделения  микобактерий

Таким  образом,  усовершенствованные  плотные  питательные  среды  ускоряют  процесс  получения  первичных  культур  микобактерий  из  взвеси,  полученных  со  стандартной  яичной  питательной  среды  на  3  ±  0,1  суток,  что  позволяет  существенно  усовершенствовать  культуральные  исследования  в  общей  схеме  бактериологических  исследований  при  туберкулезе  крупного  рогатого  скота. 

Исследованиями,  проведенными  с  75  пробами  патологоанатомического  материала,  полученного  от  больных  туберкулезом  животных,  имеющих  классические  туберкулезные  изменения  (9  проб),  незначительные  увеличения  лимфатических  узлов  (13  проб),  а  так  же  без  патологоанатомических  изменений  (53  пробы),  с  использованием  предпосевной  обработке  по  Аликаевой  А.П.  [1]  и  посева  на  элективные  питательные  среды  Левенштейна-Йенсена  и  усовершенствованные  плотные  питательные  среды,  установлено,  что  классические  микобактериальные  культуры  в  R  и  S  формах  в  виде  единичных  колоний  получены  на  31±0,9  сутки  после  посева  (табл.  2). 

Необходимо  заметить,  что  на  усовершенствованных  средах  наблюдалось  более  интенсивное  образование  количества  колоний.  Культуры  на  питательных  средах  со  временем  уплотнялись  и  к  37±0,8  суткам  обнаруживались  на  1/4  поверхности.  Результаты  роста  были  подтверждены  микроскопическими  исследованиями  после  окрашивания  по  методу  Циль-Нильсена.  В  поле  зрения  обнаруживали  кислотоустойчивые  палочки  красного  цвета.  На  основании  биохимических  исследований  изолированные  культуры  были  отнесены  к  M.  bovis.  Необходимо  отметить,  что  среди  проб,  отобранных  с  явными  туберкулезными  поражениями,  в  100%  случаев  выделены  культуры  микобактерий  на  средах  Левенштейна-Йенсена  и  усовершенствованных. 

Таблица  2. 

Результаты  сравнительного  изучения  усовершенствованных  питательных  сред  для  выделения  микобактерий  из  патологоанатомического  материала

На  посевах,  полученных  из  проб  4275,  5914,  3649,  3885,  4245,  6033,  5840,  043,  4032,  7199,  5227,  5894,  5217  (с  увеличенных  средостенных,  бронхиальных  и  заглоточных  лимфатических  узлов  с  кровоизлияниями),  первичный  рост  на  среде  Левенштейна-Йенсена  в  виде  S-форм  на  32±0,9  сутки  проявился  в  2  пробах,  что  составило  15,4  %  от  общего  числа  исследованных  проб.  На  усовершенствованной  среде  первичный  рост  проявился  на  33±0,8  сутки  в  виде  сплошных  R  и  S  колоний  в  6  пробах,  что  составило  46,1  %  соответственно.

Анализируя  полученные  данные  при  исследовании  патологоанатомического  материала,  следует  сделать  вывод  о  том,  что  стабильные  бактериальные  формы  культур  микобактерий  обнаруживались  на  средах  Левенштейна-Йенсена  и  усовершенствованных  плотных  питательных  средах  в  9  пробах,  т.  е.  в  100  %  случаев  с  классическими  туберкулезными  изменениями  (бронхиальные  и  средостенные  лимфатические  узлы  с  казеозными  туберкулезными  поражениями).

Таким  образом,  усовершенствованные  плотные  питательные  среды  ускоряют  процесс  получения  первичных  культур  микобактерий  на  3  ±  0,1  суток,  что  позволяет  существенно  усовершенствовать  культуральные  исследования  в  общей  схеме  бактериологических  исследований  при  туберкулезе  крупного  рогатого  скота. 

Список  литературы:

1. Аликаева  А.П.  Упрощенный  метод  выделения  и  выращивания  чистых  культур  туберкулезных  бацилл  из  патологического  материала  /  А.П.  Аликаева  //  Сов.  ветеринария.  —  1940  —  №  11.  —  С.  12.
2. Голышевская  В.И.  Бактериологические  методы  исследования  при  заболеваниях  органов  дыхания  /  В.И.  Голышевская  //  Пробл.  туб.  —  1997  —  №  5.  —  С.  51—53.
3. Кадочкин  A.M.  Дифференциация  и  идентификация  микобактерий  //  Ветеринария  —  1987.  —  №  9.  —  С.  62—63,  128.
4. Кузин  А.И.  Латентная  туберкулезная  инфекция  и  ее  значение  в  эпизоотологии  туберкулеза  крупного  рогатого  скота.  //  Автореф.  докт.  ветер.  наук.  М.  1977.
5. Ощепков  В.Г.  Ускоренная  диагностика  туберкулеза  крупного  животных  /  В.Г.  Ощепков,  Л.А.  Таллер,  Е.Ю.  Секин  и  др.  //  Ветеринарная  медицина  —  2010.  —  №  94.  —  С.  136—137.
6. Тупота  Н.Л.  Диагностическая  значимость  различных  методов  выявления  микобактерий  /  Н.Л.  Тупота,  С.В.  Ионина,  Н.А.  Донченко  и  др.  //  Ветеринария.  —  2010.  —  №  3.  —  С.  56—58.