ТЕСТИРОВАНИЕ  БИОЛОГИЧЕСКОЙ  АКТИВНОСТИ  ЭКСТРАКТОВ  МЕДУЗЫ  GONIONEMUS  VERTENS

Синцова  Оксана  Владимировна

аспирант,  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail :  sintsova0@mail.ru

Козловский  Сергей  Антонович

студент,  Дальневосточный  Федеральный  Университет,  РФ,  г.  Владивосток

E -mail:  sergeimerx@gmail.ru

Пислягин   Евгений  Александрович

канд.  биол.  наук,  мл.  науч.  сотр  лаборатории  биоиспытаний  и  механизма  действия  биологически  активных  веществ,  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail :  pyslyagin@hotmail.com

Агафонова  Ирина  Григорьевна

канд.  биол.  наук,  ст.  науч.  сотр  лаборатории  биоиспытаний  и  механизма  действия  биологически  активных  веществ,  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

Е-mail :  grigorievna@mail.ru

Монастырная  Маргарита  Михайловна

д-р  хим.  наук,  в.н.с.  лаборатории  химии  пептидов,

Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова

Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  город  Владивосток

E-mail:  

Козловская  Эмма  Павловна

д-р  хим.  наук,  профессор,  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail:  

TESTING  OF  BIOLOGICAL  ACTIVITY  OF  THE  JELLYFISH  GONIONEMUS  VERTENS  EXTRACTS

Oksana  Sintsova

PhD  Student  of  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  BioorganicChemistry,

Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia,  Vladivostok

Sergei  Kozlovskiy

student,  Far  Eastern  Federal  University,  Russia,  Vladivostok

Pislyagin  Evgeny

PhD,  junior  researcher  of  Laboratory  of  Bioassays  and  Mechanism  of  action  of  Biologically  Active  Substances,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia,  Vladivostok

Agafonova  Irina

PhD,  senior  researcher,  of  Laboratory  of  Bioassays  and  Mechanism  of  action  of  Biologically  Active  Substances,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia,  Vladivostok

Margarita  Monastyrnaya

doctor  of  Chemistry,  leading  research  worker  of  the  laboratory  of  Peptide  Chemistry,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia,  Vladivostok

Emma  Kozlovskaya

Doctor  of  Chemistry,  Professor,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia,  Vladivostok

Работа  выполнена  при  частичной  финансовой  поддержке  Российского  научного  фонда  (проект  №  14-25-00037)  и  комплексной  программы  фундаментальных  исследований  ДВО  РАН  «Дальний  Восток»  42П.

АННОТАЦИЯ

Для  выявления  фармакологического  потенциала  соединений,  продуцируемых  распространенной  в  прибрежных  водах  Японского  моря  ядовитой  медузой  Gonionemus  vertens,  приготовлены  и  протестированы  водный,  водно-этанольный  и  этанольный  экстракты  цельного  организма.  Показано,  что  медуза  G.  vertens  является  источником  инсектотоксинов,  метастатических  и  иммуностимулирующих  соединений.

ABSTRACT

To  identify  potential  pharmacological  compounds  produced  by  the  widespread  in  the  coastal  waters  of  the  Japan  Sea  poisonous  jellyfish  G.  vertens,  3  extracts  from  whole  body  (water,  water-ethanol  and  ethanol)  was  prepared  and  tested.  It  is  shown  that  the  jellyfish  G.  vertens  is  source  of  insectotoxins,  metastatic  and  immunostimulatory  compounds.

Ключевые  слова :  медуза;  Gonionemus  vertens;  инсектотоксины;  биологически  активные  вещества.

Keywords :  jellyfish;  Gonionemus  vertens;  insectotoxins;  biologically  active  compounds.

Медузы  относятся  к  типу  Стрекающие,  животных  этого  типа  отличает  наличие  специализированных  жалящих  клеток  —  нематоцистов,  содержащих  в  себе  ядовитый  секрет  и  предназначенных  для  его  доставки.  Известно,  что  медузы  являются  богатым  источником  биологически  активных  соединений,  проявляющих  цитолитическую,  цитотоксическую,  ферментативную  активность,  обладающих  кардио-  и  нейротоксичностью  [5;  7—9;  13;  19—23].  Однако  содержащиеся  в  нем  полипептиды  недостаточно  полно  охарактеризованы:  аминокислотные  последовательности  установлены  лишь  для  единичных  токсинов,  более  того,  ничего  не  известно  о  строении  кодирующих  их  генов  [11;  12].  Помимо  ядовитых  полипептидов  в  медузах  обнаружены  другие  белковые  компоненты,  которые  используют  при  лечении  некоторых  заболеваний  или  же  в  научных  исследованиях.  Так,  например,  из  медузы  Aequorea  victoria,  обитающей  в  Тихом  океане,  Атлантике  и  Средиземном  море,  выделен  зеленый  флуоресцентный  белок  (GFP),  служащий  важным  маркером  при  идентификации  экспрессии  генов  в  клетке,  а  также  применяющийся  в  молекулярной  биологии  [18].  Крупная  медуза  Желтого  и  Восточно-Китайского  морей  Nemopilema  nomurai  является  источником  гликопротеина  из  семейства  муцинов,  который  рассматривают  в  качестве  потенциального  фармакологического  агента  для  лечения  остиоартритов  [14;  16].  Показано,  что  гидролизованый  коллаген  медуз  проявляет  положительные  фармакологические  эффекты,  такие  как  ингибирование  активности  ангиотензинпревращающего  фермента  [24]  и  подавление  артериальной  гипертензии  [25].  Имеются  данные  о  том,  что  сам  по  себе  коллаген  медуз  обладает  иммуностимулирующей  активностью  [15].

Рисунок  1.  Медуза  Gonionemus   vertens  [17]

Объектом  нашего  исследования  является  ядовитая  гидромедуза  Gonionemus  vertens,  так  называемый  «крестовик»,  обитающая  в  прибрежных  водах  северной  части  Тихого  океана  (от  Китая  до  Калифорнии)  [2,  c.  43].  Размер  колокола  этой  медузы  достигает  25  мм  в  диаметре,  по  его  краю  расположено  около  80  щупалец,  содержащих  ядовитый  секрет.  Медуза  G.  vertens  обитает  на  небольших  глубинах,  во  время  полового  размножения  она  близко  подходит  к  берегу  и  представляет  опасность  для  контактирующих  с  ней  купающихся.  Клиническая  картина  поражения  «крестовиком»  характеризуется  резкой  болью  и  сыпью  в  местах  «ожога»,  наблюдается  выраженное  падение  тонуса  мышц  конечностей,  агония  распространяется  также  и  на  дыхательную  мускулатуру.  По  мере  развития  отравления  у  некоторых  развивается  временная  слепота,  глухота,  помрачение  сознания.  Со  стороны  сердечно-сосудистой  системы  отмечается  тахикардия  и  незначительное  повышение  артериального  давления  [1,  c.  38—39].  Такие  множественные  токсические  эффекты  могут  указывать  на  большое  количество  биологически  активных  веществ  в  составе  яда  данной  медузы,  которые,  несомненно,  представляют  значительный  интерес  для  исследования. 

Для  поиска  белковых  компонентов,  продуцируемых  G.  vertens,  использовали  свежевыловленных  цельных  животных,  из  которых  готовили  водные,  водно-этанольные  и  этанольные  экстракты.  Образцы  животных  были  собраны  во  время  I  полевой  экспедиции  на  Морской  экспериментальной  станции  ТИБОХ  ДВО  РАН.  Концентрацию  белка  в  экстрактах  определяли  методом  Лоури.  Наличие  в  них  соединений,  обладающих  биологической  активностью,  устанавливали  с  использованием  следующих  моделей:  личинки  мясной  мухи  Caliphora  sp.  —  для  обнаружения  инсектотоксинов,  спленоциты  мыши  Mus  musculus  —  острой  токсичности,  прибрежные  крабы  Paralithodes  sp.  —  нейротоксичности,  эритроциты  мыши  M.  musculus  —  гемолитической,  макрофаги  мыши  M.  musculus  —  метастатической  и  яйцеклетки  морского  ежа  Strongylocentrotys  intermedius  —  эмбриотоксической  активности.  Для  определения  антибактериальной  активности  экстрактов  медузы  использовали  пять  видов  бактерий:  Escherichia  coli,  Candida  albicans,  Staphylococcus  aureus,  Bacillus  subtilis,  Pseudomonas  aeruginosa.  Трипсинингибирующую  активность  экстрактов  определяли  с  помощью  синтетического  субстрата,  n-нитроанилида  N-бензоил-D,  L-аргинина.

Поиск  селективных  инсектицидов  биологического  происхождения  всегда  актуален,  и  медузы  могут  быть  источником  таких  соединений.  B  последние  годы  появились  генетические  данные,  свидетельствующие  в  пользу  более  тесного  родства  насекомых  и  ракообразных  [3;  4].  Так  как  морские  беспозвоночные  контактируют  с  ракообразными,  то  в  них  могут  присутствовать  соединения,  проявляющие  инсектотоксичность.  Исследование  токсичности  на  прибрежных  крабах  показало,  что  токсичны  как  водный,  так  и  этанольный  экстракты  медузы,  однако  они  различаются  по  характеру  действия.  Водный  экстракт  оказывает  на  организм-мишень  мгновенное  паралитическое  действие,  сопровождающееся  судорогами,  после  чего  в  течение  полутора  часов  краб  остается  неподвижным,  но  по  истечении  этого  времени  начинает  подавать  признаки  жизни.  Данный  экстракт  активен  как  в  концентрации  625  мкг/мл,  так  и  при  ее  десятикратном  снижении.  Действие  этанольного  экстракта  медузы  начинает  проявляться  спустя  8  минут  после  его  введения,  первоначально  потерей  подвижности  краба  и  последующей  смертью.  По  отношению  к  личинкам  мясной  мухи  наблюдается  аналогичное  действие:  мгновенный  паралич  личинки  и  ее  возвращение  к  нормальному  состоянию  спустя  несколько  часов  при  введении  водного  экстракта  медузы  в  тех  же  концентрациях,  и  смерть  при  введении  этанольного  экстракта. 

Тестирование  водного,  водно-этанольного  и  этанольного  экстрактов  медузы  на  наличие  острой  токсичности  (на  спленоцитах),  эмбриотоксичности  гемолитической,  антимикробной,  и  трипсинингибирующей  активности  показало  отрицательные  результаты. 

Однако  интересными  оказались  результаты  исследования  изменения  адгезии  макрофагов.  Согласно  литературным  [6]  и  полученным  нами  данным  водный  экстракт  медузы  может  проявлять  метастатическое  действие,  так  как  не  является  токсичным  по  отношению  к  клеткам  крови,  и  изменение  адгезии  макрофагов  не  вызвано  их  гибелью.  Водно-этанольный  экстракт  медузы  обладает  противоположным  действием,  он  увеличивает  адгезию  макрофагов  почти  в  два  раза.  Такой  эффект  указывает  на  возможность  наличия  иммуностимулирующего  действия  этого  экстракта,  что  не  удивительно,  так  как  в  литературных  источниках  имеются  данные  об  иммуностимулирующем  действии  коллагена  медуз  [15].

Таблица  1. 

Результаты  тестирования  биологической  активности  экстрактов  медузы  G.  vertens.

В  результате  проделанной  работы  показано,  что  медуза  G.  vertens  является  источником  метастатических  и  иммуностимулирующих  соединений,  а  также  инсекто-  и  нейротоксинов.  Планируется  идентифицировать  природу  этих  соединений,  установить  структуру  и  механизм  действия  с  целью  дальнейшего  создания  на  их  основе  цитопротекторов.

Список  литературы:

1.Орлов  Б.Н.,  Гелашвили  Д.Б.  Зоотоксинология  (ядовитые  животные  и  их  яды):  учеб.  пособие  для  студентов  вузов  по  спец.  «Биология».  М.:  Высш.  шк.,  1985.  —  280  с.

2.Явнов  С.В.  Атлас  кишечнополостных  дальневосточных  морей  России  под  ред.  В.И.  Чучукало.  Владивосток:  Русский  Остров,  2010.  —  168  с.

3.Baurain  D.,  Brinkmann  H.,  Philippe  H.  Lack  of  resolution  in  the  animal  phylogeny:  closely  spaced  cladogeneses  or  undetected  systematic  errors?  //  Mol.  Biol.  Evol.  —  2007.  —  V.  24  (1),  —  P.  6—9.

4.Boore  J.L.,  Lavrov  D.V.,  Brown  W.M.  Gene  translocation  links  insects  and  crustaceans  //  Nature.  —  1998.  —  V.  392.  —  P.  667—668.

5.Burnett  J.W.,  Calton  G.J.  Venomous  pelagic  coelenterates  —  chemistry,  toxicology,  immunology  and  treatment  of  their  stings  //  Toxicon.  —  1987.  —  V.  25.  —  P.  581—602.

6.Glinsky  G.V.  Anti-adhesion  cancer  therapy  //  Cancer  and  metastasis  reviews.  —  1998.  —  V.  17.  —  P.  177—185.

7.Helmholz  H.  Selective  toxin-lipid  membrane  interactions  of  natural,  haemolytic  scyphozoan  toxins  analyzed  by  surface  plasmon  resonance  //  Biochim.  Biophys.  Acta  Biomembr.  —  2010.  —  V.  1798.  —  P.  1944—1952.

8.Helmholz  H.,  Johnston  B.D.,  Ruhnau  C.,  Prange  A.  Gill  cell  toxicity  of  northern  boreal  scyphomedusae  Cyanea  capillata  and  Aurelia  aurita  measured  by  an  in  vitro  cell  assay  //  Hydrobiologia.  —  2010.  —  V.  645.  —  P.  223—234.

10.Helmholz  H.,  Ruhnau  C.,  Schütt  C.,  Prange  A.  Comparative  study  on  the  cell  toxicity  and  enzymatic  activity  of  two  northern  scyphozoan  species  Cyanea  capillata  (L.)  and  Cyanea  lamarckii  (Peron  &  Leslieur)  //  Toxicon.  —  2007.  —  V.  50.  —  P.  53—64.

11.Lassen  S.,  Helmholz  H.,  Ruhnau  C.,  Prange  A.  A  novel  proteinaceous  cytotoxin  from  the  northern  Scyphozoa  Cyanea  capillata  (L.)  with  structural  homology  to  cubozoan  haemolysins  //  Toxicon.  —  2011.  —  V.  57.  —  P.  721—729.

12.Lassen  S.,  Wiebring  A.,  Helmholz  H.,  Ruhnau  C.,  Prange  A.  Isolation  of  a  Nav  channel  blocking  polypeptide  from  Cyanea  capillata  medusae  –  A  neurotoxin  contained  in  fishing  tentacle  isorhizas  //  Toxicon.  —  2012.  —  V.  59.  —  P.  610—616.

13.Long  K.O.,  Burnett  J.W.  Isolation,  characterization,  and  comparison  of  hemolytic  peptides  in  nematocyst  venoms  of  two  species  of  jellyfish  (Chrysaora  quinquecirrha  and  Cyanea  capillata)  //  Comp.  Biochem.  Physiol.  —  1989.  —  V.  94B.  —  P.  641—646.

14.Masuda  A.,  Baba  T.,  Dohmae  N.,  Yamamura  M.,  Wada  H.,  Ushida  K.  Mucin  (Qniumucin),  a  glycoprotein  from  jellyfish,  and  determination  of  its  main  chain  structure  //  J.  Nat.  Prod.  —  2007.  —  V.  70.  —  P.  1089—1092.

15.Morishige  H.,  Sugahara  T.,  Nishimoto  S.,  Muranaka  A.,  Ohno  F.,  Shiraishi  R.,  Doi  M.  Immunostimulatory  effects  of  collagen  from  jellyfish  in  vivo  //  Cytotechnology.  —  2011.  —  V.  63.  —  P.  481—492.

16.Ohta  N.,  Sato  M.,  Ushida  K.,  Kokubo  M.,  Baba  T.,  Taniguchi  K.,  Urai  M.,  Kihira  K.,  Mochida  J.  Jellyfish  mucin  may  have  potential  disease-modifying  effects  on  osteoarthritis  //  BMC  Biotechnol.  2009.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:http://www.biomedcentral.com.sci-hub.org/1472-6750/9/98/  (дата  обращения  15.10.2014).

17.Schuchert  P.  World  Hydrozoa  database.  2014.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://www.marinespecies.org/hydrozoa  (дата  обращения  2.11.2014).

18.Shimomura  O.  Structure  of  the  chromophore  of  Aequorea  green  fluorescent  protein//  FEBS  Lett.  —  1979.  —  V.  104.  —  P.  220—222.

19.Walker  M.J.A.  Cardiac  actions  of  a  toxin-containing  material  from  jellyfish,  Cyanea  capillata  //  Toxicon.  —  1977.  —  V.  15.  —  P.  15—27.

20.Walker  M.J.A.  Pharmacological  and  biochemical  properties  of  a  toxin  containing  material  from  jellyfish,  Cyanea  capillata  //  Toxicon.  —  1977.  —  V.  15.  —  P.  3—14.

21.Walker  M.J.A.,  Martinez  T.T.,  Godin  D.V.  Investigations  into  cardiotoxicity  of  a  toxin  from  nematocysts  of  jellyfish,  Cyanea  capillata  //  Toxicon.  —  1977.  —  V.  15.  —  P.  339—346.

22.Xiao  L.,  Liu  G.S.,  Wang  Q.Q.,  He  Q.,  Liu  S.H.,  Li  Y.,  Zhang  J.,  Zhang  L.M.  The  lethality  of  tentacle-only  extract  from  jellyfish  Cyanea  capillata  is  primarily  attributed  to  cardiotoxicity  in  anaesthetized  SD  rats  //  Toxicon.  —  2010.  —  V.  55.  —  P.  838—845.

23.Xiao  L.,  Zhang  J.,  Wang  Q.Q.,  He  Q.A.,  Liu  S.H.,  Li  Y.,  Zhang  L.M.  In  vitro  and  in  vivo  haemolytic  studies  of  tentacle-only  extract  from  jellyfish  Cyanea  capillata  //  Toxicol.  —  2010.  —  V.  24.  —  P.  1203—1207.

24.Zhuang  Y.,  Sun  L.,  Li  B.  Production  of  the  angiotensin-Iconverting  enzyme  (ACE)-inhibitory  peptide  from  hydrolysates  of  jellyfish  (Rhopilema  esculentum)  collagen  //  Food  Bioprocess  Technol.  —  2010.  —  V.  5.  —  P.  1622—1629.

25. Zhuang  Y.,  Sun  L.,  Zhang  Y.,  Liu  G.  Antihypertensive  effect  of  long-term  oral  administration  of  jellyfish  (Rhopilema  esculentum)  collagen  peptides  on  renovascular  hypertension  //  Mar.  Drugs.  —  2012.  —  V.  10.  —  P.  417—426.