ОТРАБОТКА  УСЛОВИЙ  ПРОБОПОДГОТОВКИ  ДЛЯ  ОПРЕДЕЛЕНИЯ  ЛЕВОМИЦЕТИНА  В  МЯСНЫХ  ПРОДУКТАХ

Уланова  Татьяна  Сергеевна

д-р  биол.  наук,  профессор,  заведующий  отделом  химико-аналитических  методов  исследования  ФБУН  «Федеральный  научный  центр  медико-профилактических  технологий  управления  рисками  здоровью  населения»,  РФ,  г.  Пермь

E-mail:  Ulanova@fcrisk.ru

Карнажицкая  Татьяна  Дмитриевна

канд.  биол.  наук,  заведующий  лабораторией  методов  жидкостной  хроматографии  ФБУН  «Федеральный  научный  центр  медико-профилактических  технологий  управления  рисками  здоровью  населения»,  РФ,  г.  Пермь

E-mail:  tdkarn@fcrisk.ru

Антипьева  Марина  Владимировна

канд.  биол.  наук,  старший  научный  сотрудник  лаборатории  методов  жидкостной  хроматографии  ФБУН  «Федеральный  научный  центр  медико-профилактических  технологий  управления  рисками  здоровью  населения»,  РФ,  г.  Пермь

Пшеничникова  Екатерина  Олеговна

химик  лаборатории  методов  жидкостной  хроматографии  ФБУН  «Федеральный  научный  центр  медико-профилактических  технологий  управления  рисками  здоровью  населения»,  РФ,  г.  Пермь

E-mail: 

ANALYSIS  OF  SAMPLE  PREPARATION  CONDITIONS  FOR  DETERMINATION  OF  CHLORAMPHENICOL  IN  MEAT  PRODUCTS

Tatyana  Ulanova

dr.Sci.Biol.,  professor,  head  of  department  of  chemical  analysis  methods  of  Federal  budget  scientific  institution  “Federal  scientific  centre  for  medical  and  preventive  health  risk  management  technologies”,  Russia  Perm

Tatyana  Karnazhitskaya

candidate  of  Biology,  head  of  the  laboratory  of  a  liquid  chromatography  of  Federal  budget  scientific  institution  “Federal  scientific  centre  for  medical  and  preventive  health  risk  management  technologies”  Russia  Perm

Marina  Antipeva

candidate  of  Biology,  senior  research  associate  of  laboratory  of  a  liquid  chromatography  of  Federal  budget  scientific  institution  “Federal  scientific  centre  for  medical  and  preventive  health  risk  management  technologies”  Russia  Perm

Ekaterina  Pshenichnikova

chemist  of  laboratory  of  a  liquid  chromatography  of  Federal  budget  scientific  institution  “Federal  scientific  centre  for  medical  and  preventive  health  risk  management  technologies”  Russia  Perm

АННОТАЦИЯ

В  статье  представлены  результаты  исследований  по  выбору  оптимальных  условий  пробоподготовки  для  определения  левомицетина  (хлорамфеникола)  в  мясе  методом  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  с  масс-спектрометрическим  детектированием.  Изучена  эффективность  извлечения  хлорамфеникола  из  мяса  методами  жидкостной  и  твердофазной  экстракции.  Установлено,  что  максимальная  степень  извлечения  составляет  99,98  %  и  достигнута  при  использовании  в  качестве  пробоподготовки  жидкостной  экстракции.

ABSTRACT

This  article  describes  analysis  results  of  sample  preparation  conditions  for  determination  of  chloramphenicol  residue  in  meat  by  LC/MS/MS  method.  Efficiency  of  extraction  of  chloramphenicol  from  meat  is  studied  by  methods  of  liquid  and  solid-phase  extraction.  The  maximum  extent  of  extraction  is  about  99,98  %.  It  is  reached  by  using  liquid  extraction  for  sample  preparation.

Ключевые  слова:  хлорамфеникол;  мясо;  жидкостная  экстракция;  твердофазная  экстракция;  высокоэффективная  жидкостная  хроматография  с  масс-спектрометрическим  детектированием.

Keywords:  cloramphenicol;  meat;  liquid  extraction;  solid-phase  extraction;  liquid  chromatography  mass  spectrometry.

Одной  из  задач  современной  аналитической  химии  является  разработка  селективных  и  высокочувствительных  методик  определения  контаминантов  в  продуктах  питания  с  целью  оценки  их  влияния  на  здоровье  населения.  К  числу  загрязнителей  пищевой  продукции  относятся  ветеринарные  препараты,  в  частности  хлорамфеникол  (левомицетин),  представитель  группы  ароматических  антибиотиков,  широко  используемый  в  ветеринарной  практике  для  борьбы  с  инфекционными  заболеваниями.  Хлорамфеникол  медленно  выводится  из  организма  животных  и  относительно  долго  сохраняет  активность  при  хранении  продуктов.  При  употреблении  продуктов  с  остаточным  содержанием  хлорамфеникола  в  организме  человека  вырабатывается  резистентность  к  антибиотику,  может  развиваться  дисбактериоз,  аллергические  реакции,  снижается  иммунитет.  В  соответствии  с  СанПиН  2.3.2.1078-01  «Гигиенические  требования  безопасности  и  пищевой  ценности  пищевых  продуктов  допустимый  уровень  остаточного  содержания  хлорамфеникола  в  продукции  составляет  0,0003  мг/кг.

При  разработке  методики  проведения  анализа  контаминантов  в  пищевых  продуктах  важное  место  занимает  пробоподготовка,  целью  которой  является  наиболее  полное  извлечение  следовых  количеств  аналита  и  эффективная  очистка  от  компонентов  биологической  матрицы. 

В  статье  представлены  результаты  исследований  по  выбору  оптимальных  условий  пробоподготовки  в  ходе  разработки  методики  определения  левомицетина  в  мясных  продуктах.

Экспериментальные  исследования  по  отработке  условий  проводились  на  жидкостном  хроматографе  Agilent  1200  в  сочетании  с  масс-спектрометрическим  детектором  с  тройным  квадруполем  LC/MS  6460  Agilent  Technologies  в  отработанных  условиях  выполнения  анализа. 

При  выборе  оптимальных  условий  подготовки  проб  к  анализу  для  получения  более  точных  результатов  при  проведении  количественного  анализа  органических  соединений  необходимо  учитывать  влияние  матричного  эффекта,  степень  извлечения  и  погрешность  подготовки  проб  к  анализу,  так  как  они  могут  в  значительной  степени  повлиять  на  конечные  результаты  измерений  [1].  С  этой  целью  проведено  сравнение  эффективности  экстракции  антибиотика  из  образцов  мясного  фарша  с  использованием  различных  способов  пробоподготовки.

В  ходе  проделанной  работы  был  исследованы  2  варианта  пробоподготовки  с  использованием  метода  твердофазной  экстракции  с  насыпными  сорбентами.  Пробоподготовка  основана  на  методе  “QuEChERS”,  используемом  для  определения  пестицидов  и  других  контаминантов  в  продуктах  питания.

В  первом  варианте  к  10  г  мясного  фарша,  с  заданным  содержанием  левомицетина,  добавляли  20  см³  ацетонитрила  и  соли,  в  основном  MgSO₄  и  NaCl,  используемые  в  качестве  высаливателей. 

Смесь  интенсивно  встряхивали,  центрифугировали  при  скорости  вращения  3000  об/мин.  Надосадочный  слой  отбирали  в  чистую  пробирку  объемом  50  см³  и  чистили  путем  добавления  в  пробирку  с  экстрактом  сорбента  и  соли  MgSO₄,  интенсивно  перемешивали  в  течение  1  минуты.  Смесь  центрифугировали  в  течение  1  мин  со  скоростью  3000  об/мин,  верхний  слой  переносили  в  чистую  пробирку,  высушивали  в  токе  воздуха  при  нагревании.  Сухой  остаток  перерастворяли  в  1  см³  смеси  ацетонитрил:вода  (1:1),  фильтровали  через  капроновый  фильтр  с  диаметром  пор  0,2  мкм  и  анализировали  аликвоту  объемом  10  мм³  методом  ВЭЖХ/МС. 

Для  расчета  степени  экстракции  использовали  характеристики,  полученные  для  основного  иона:  площадь  (S  321->152)  и  отношение  сигнал/шум  (SNR  321->152).  Степень  экстракции  левомицетина  составила  33  %. 

В  отличие  от  1-го  (безводного)  варианта,  исключающего  присутствие  воды,  во  2-ом  варианте  экстракция  протекала  в  водной  среде.  2г  мясного  фарша,  с  заданным  содержанием  левомицетина,  помещали  в  центрифужную  пробирку  вместимостью  50  см³,  к  образцу  добавляли  дистиллированную  воду  (8—10  см³).  Смесь  интенсивно  встряхивали  в  течение  1  минуты,  добавляли  10  см³  1  %-го  раствора  уксусной  кислоты  в  ацетонитриле,  интенсивно  встряхивали  в  течение  5  минут,  добавляли  набор  для  ТФЭ  с  насыпным  сорбентом  для  анализа  мясных  и  молочных  продуктов,  встряхивали  в  течение  1  минуты  и  центрифугировали  при  скорости  вращения  4000  об/мин.  Надосадочный  слой  отбирали  в  чистую  пробирку  объемом  15  см³,  содержащую  сорбент  для  очистки  экстракта,  интенсивно  встряхивали  в  течение  2  минут,  центрифугировали  при  скорости  вращения  4000  об/мин.  Верхний  слой  растворителя  переносили  в  новую  пробирку,  высушивали  в  токе  воздуха  при  температуре  40  ^оС,  перерастворяли  в  0,8  см³  раствора  метанол/вода/0,1  %  уксусная  кислота.  Экстракт  фильтровали  через  капроновый  фильтр  и  анализировали  в  количестве  10  мм³  методом  ВЭЖХ/МС.  Степень  экстракции  хлорамфеникола  из  образцов  мяса  составляет  41,0  %. 

Наиболее  широко  используемым  приемом  извлечения  анализируемых  веществ  из  биологических  сред,  в  том  числе  продуктов  питания,  является  экстракция  [2].  Изучена  эффективность  извлечения  левомицетина  из  мяса  методом  жидкостной  экстракции  с  использованием  в  качестве  экстрагента  этилацетата.  Процедура  пробоподготовки  заключалась  в  двойной  экстракции  10  г  мясного  фарша,  с  заданным  содержанием  левомицетина,  этилацетатом.  Объединенные  экстракты  высушивали  в  токе  воздуха  на  водяной  бане  до  образования  остатка  в  виде  маслянистой  капли.  К  остатку  добавляли  2  см³  метанола,  25  см³  4  %-ного  водного  раствора  хлорида  натрия  и  20  см³  гексана.  Содержимое  пробирки  интенсивно  встряхивали  и  центрифугировали  в  течение  5  мин  со  скоростью  3000  об/мин.  Верхний  (гексановый)  слой  отбрасывали  и  проводили  повторную  очистку  гексаном.  К  оставшемуся  раствору  добавляли  15  см³  этилацетата,  тщательно  перемешивали,  центрифугировали  со  скоростью  3000  об/мин.  Верхний  слой  (слой  этилацетата)  переносили  в  чистую  пробирку,  проводили  повторную  жидкостную  экстракцию  этилацетатом.  Объединенный  экстракт  высушивали  досуха  на  водяной  бане  при  температуре  45  ^оС.  Остаток  растворяли  в  1  см³  смеси  метанол:вода=1:1,  фильтровали  через  капроновый  фильтр  и  анализировали  аликвоту  объемом  10  мм³  методом  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  с  масс-спектрометрическим  детектированием  (ВЭЖХ/МС).

Степень  экстракции  левомицетина  составила  99,98  %.  Результаты  анализа  представлены  в  таблице  2.

С  целью  сравнения  эффективности  извлечения  хлорамфеникола  из  мясных  продуктов  различными  способами  дополнительно  проведены  исследования  по  определению  хлорамфеникола  из  продуктов  животного  происхождения  согласно  действующим  методическим  указаниям  МУК  4.1.1912-04  «Определение  остаточных  количеств  левомицетина  (хлорамфеникола,  хлормицетина)  в  продуктах  животного  происхождения  методом  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  и  иммуноферментного  анализа».

10  г  мясного  фарша,  с  заданным  содержанием  левомицетина,  гомогенизировали  с  15см³  фосфатного  буфера  (0,025  М  КН₂Р0₄  +  0,025  М  Na₂НР0₄)  рН  =  6,88  и  экстрагировали  3  раза  по  30  см³  этилацетата.  Полученную  взвесь  центрифугировали  15  мин  при  4000  об./мин  и  декантировали  этилацетатный  слой,  промывали  последовательно  5  см³  насыщенного  раствора  NaС1  с  добавлением  0,2  мл  10  %-ного  NaОН;  5  мл  насыщенного  раствора  NaС1  с  добавлением  0,2  мл  10  %-ного  СН₃СООН  и  5  см³  насыщенного  раствора  NaС1.  Органический  слой  отбирали  и  упаривали  на  ротационном  испарителе  (при  50  °С)  до  возможно  минимального  объема,  отдували  азотом  до  исчезновения  запаха  органических  растворителей,  добавляли  3  см³  смеси  ацетонитрил:вода  (1:4)  и  экстрагировали  3  раза  5  см³  петролейного  эфира,  петролейный  эфир  отбрасывали  и  извлекали  хлорамфеникол  экстракцией  этилацетатом  (3  раза  по  5  см³).  Этилацетатный  слой  упаривали  досуха,  растворяли  в  0,1  см³  метанола  и  анализировали  аликвотное  количество  раствора.  Степень  экстракции  хлорамфеникола  из  образцов  мяса  составила  56,4  %. 

Результаты  исследований  по  определению  эффективности  извлечения  хлорамфеникола  методом  жидкостной  экстракции,  твердофазной  экстракции  с  насыпным  сорбентом  и  по  методическим  указаниям  МУК  4.1.1912-04  приведены  в  таблице  2.

Таблица  1.

Сравнение  эффективности  способов  извлечения  хлорамфеникола  из  мясной  матрицы

При  сравнении  полученных  результатов  установлено,  что  оптимальным  способом  экстракции  хлорамфеникола  из  мясных  продуктов  является  жидкостная  экстракция  с  использованием  в  качестве  растворителя-экстрагента  этилацетата  с  последующей  очисткой  экстракта  гексаном.  В  данном  случае  достигнута  100  %-ная  экстракция  хлорамфеникола  с  учетом  матричного  эффекта. 

Таким  образом,  в  ходе  проведенных  экспериментальных  исследований  отработан  оптимальный  способ  подготовки  проб  мяса  к  анализу  для  определения  левомицетина  методом  ВЭЖХ/МС,  заключающийся  в  извлечении  левомицетина  из  мяса  жидкостной  экстракцией  этилацетатом  и  очисткой  экстракта  гексаном.  Способ  характеризуется  высокой  степенью  извлечения,  экспрессностью  и  простотой  выполнения.  Данный  способ  пробоподготовки  может  быть  использован  при  разработке  метода  определения  левомицетина  в  мясных  продуктах.

Список  литературы:

1.Онищенко  Г.Г.  Руководство  «Контроль  содержания  химических  соединений  и  элементов  в  биологических  средах»  /  Н.В.  Зайцева,  Т.С.  Уланова  Пермь:  Книжный  формат,  2011.  —  520  с.

2.Leo  M.L.  Nollet.  Analysis  of  endocrine  disrupting  compounds  in  food.  Blackkwell  Publishing  Ltd,  2001.  —  491  p.