КОМПЛЕКСНОЕ  ФИТОХИМИЧЕСКОЕ  ИЗУЧЕНИЕ  JUNIPERUS  SABINA  L.  ИЗ  КАЗАХСТАНА

Cүлеймен  Ерлан  Мэлсұлы

канд.  хим.  наук,  PhD,  директор  института  прикладной  химии,  доцент  кафедры  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Казахстан  г.  Астана 

Е-mail: 

Ишмуратова  Маргарита  Юлаевна

канд.  биол.  наук,  доцент  кафедры  фармацевтических  дисциплин  Карагандинского  университета  «Болашак»,  Казахстан  г.  Караганда 

Е-mail: 

Искакова  Жанар  Бактыбаевна

канд.  хим.  наук,  старший  научный  сотрудник  института  прикладной  химии,  доцент  кафедры  Казахского  университета  технологии  и  бизнесса,  Казахстан  г.  Астана 

Е-mail: 

COMPREHENSIVE  PHYTOCHEMICAL  STUDY  OF  JUNIPERUS  SABINA  L.  FROM  KAZAKHSTAN

Suleimen  Yerlan  Melsuly

candidate  of  Chem.  Science,  PhD,  Director  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  ENU,  Associate  Professor  of  Chemistry  Department  of  L.N.  Gumilev  ENU,  Astana,  Kazakhstan

Ishmuratova  Margarita  Yulaevna

candidate  of  biol.  Sciences  ,  assistant  Professor  of  Pharmaceutical  Sciences

Karaganda  University  "Bolashak"  Karaganda,  Kazakhstan

Искакова  Жанар  Бактыбаевна

candidate  of  Chem.  Science,  Senior  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  ENU,  Associate  Professor  of  Kazakh  University  of  Technology  and  Business,  Astana,  Kazakhstan

Работа  выполнена  по  гранту  МОН  РК  по  бюджетным  программам  055  «Фундаментальные  и  прикладные  научные  исследования»  по  теме  «Фитохимическое  изучение  растений  Казахстана  и  Сибири.  Создание  модифицированных  производных  на  основе  моно-  и  сесквитерпеноидов,  флаваноидов  и  их  биоскрининг»  и  «Создание  образцов  продукции  под  брендом  «Ароматы  степей  Казахстана».  Авторы  благодарят  Ш.  Хан,  Б.  Теквани  и  М.  Джакоб  (университет  Миссиссипи,  США)  за  помощь  в  исследовании  биоактивности  (грант  USDA  Agricultural  Research  Service  Specific  Cooperative  Agreement).

АННОТАЦИЯ

Проведено  изучение  антигрибковой,  антимикробной,  антилейшманиозной,  антималярийной  и  цитотоксической  активности  эфирного  масла  Juniperus  sabina  L.,  определен  микроэлементный  состав  растительного  сырья  и  изучено  анатомическое  строение.

ABSTRACT

The  study  of  antifungal,  antimicrobial,  antileyshmanial,  antimalarial  and  cytotoxic  activity  of  essential  oils  Juniperus  sabina  L.,  definition  of  microelement  composition  and  anatomy  structure  of  plant  material  was  done.

Ключевые  слова:  антигрибковая;  антимикробная;  антилейшманиозная;  антималярийная  и  цитотоксическая  активность;  эфирное  масло;  микроэлементный  состав;  анатомическое  строение;  Juniperus  sabina  L.

Keywords:  antifungal;  antimicrobial;  antileyshmanial;  antimalarial  and  cytotoxic  activity;  essential  oils;  microelement  composition;  anatomy;  Juniperus  sabina  L.

Juniperus  sabina  L.  (можжевельник  казацкий)  —  двудомный  стелющийся  кустарник  высотой  1—1,5  м.  Быстро  разрастается  в  ширину  и  образует  плотные  заросли.  Распространен  на  Кавказе,  Урале,  Сибири,  Приморье,  Южной  и  Центральной  Европе.  Произрастает  в  Центральном  и  Северном  Казахстане  в  гористой  местности  [7].

Ранее  был  изучен  состав  эфирного  масла  [8—9],  в  том  числе  и  нами  масло  из  Казахстана  [17].

Экстракт  J.  sabina  обладает  противоопухолевым  эффектом,  превосходящим  противоопухолевую  активность  экстракта  тисового  дерева  Taxus  baccata  [15].

Эфирное  масло  J.  sabina  обладает  выраженным  абортивным  эффектом  [11,  13—14],  антимикробной  [9]  и  антиоксидантной  активностью  [10,  12].

В  связи  с  тем,  что  эфирное  масло  данного  растения  представляет  интерес  с  точки  зрения  его  биоактивности  мы  провели  изучение  его  антигрибковой,  антимикробной,  антилейшманиозной,  антималярийной  и  цитотоксической  активности.

Сырье  J.  sabina  собирали  в  июне  2011  г.  в  Павлодарской  области  с.  Баянаул  (лагерь  «Кристалл»)  Республики  Казахстан.  Эфирное  масло  получали  методом  гидродистилляции  на  аппарате  Клевенджера  в  течение  2-х  часов  [2].  Выход  масла  составил  1,5—1,9  %.

На  антимикробную  активность  проверяли  образцы  эфирных  масел,  их  способность  ингибировать  рост  из  5  бактерий  и  5  грибков,  патогенных  для  человека.

Вначале  испытывали  в  первичном  скрининге  на  50  мкг/мл  дважды  и  процент  ингибирования  роста  (%  инг.)  рассчитывался  по  отношению  к  отрицательному  и  положительному  контролю.  Эфирные  масла  показывающие  ≥  50%  ингибирования  направляли  на  вторичный  скрининг.

Во  вторичном  скпининге  образцы  растворяли  в  20  мг/мл  и  проверяли  при  50,  10  и  2  мкг/мл  и  IC₅₀s  против  всех  10  штаммов  микроорганизмов.  Образцы  растворяли  в  2  mg/mL  и  проводили  испытания  на  20,  4,  0,8  мкг/мл  и  IC₅₀s  против  всех  10  штаммов  микроорганизмов.  Чистые  соединения,  которые  имеют  IC₅₀  ≤  7  мкг/мл  на  вторичном  скрининге  направляли  на  третичный  скрининг.

В  третичном  скрининге  чистые  соединения  проверены  против  всех  10  микробов  в  20,  10,  5,0,  ...  0,02  мкг/мл  и  рассчитывали  IC₅₀s.  В  дополнение  к  IC₅₀  проводили  расчет  MIC  (минимальная  ингибирующая  концентрация),  и  либо  MFC  или  МБК  (минимальная  фунгицидная  или  бактерицидная  концентрация,  соответственно).  MIC  является  самой  низкой  тест  концентрацией  (в  мкг/мл),  который  подавляет  в  организме  100  %.  MFC  или  MBC  является  самой  низкой  тест-концентрацией  (в  мкг/мл),  которая  убивает  организм.  Чистые  соединения  могут  иметь  MIC,  при  которой  клетки  могут  быть  еще  живы,  но  без  роста.  MFC  и  MBC  является  показателем  способности  образца  уничтожать  испытуемый  образец.

В  качестве  контроля  как  противогрибкового  препарата  использовали  амфотерицин  В  и  как  антибактериальный  препарат  —  ципрофлоксацин.

Как  видно  из  таблицы  1,  эфирное  масло  J.  sabina  оказывает  слабовыраженную  активность  лишь  в  отношении  штаммов  Candida  neoformans.

Таблица  1. 

Антигрибковая  и  антимикробная  активность  эфирного  масла  J.  sabina  L.

Полученные  данные  не  согласуются  с  литературными  [9]:  согласно  ним  минимальная  ингибирующая  концентрация  для  штаммов  C.  albicans,  S.  aureus  и  E.  coli  составила  3,125  и  против  штамма  S.  aureus  —  6,25  мг/мл,  что  связано,  видимо,  с  различием  в  составе  эфирного  масла.

Антилейшманиозную  активность  образцов  определяли  по  способности  ингибировать  Leishmania  donovani,  простейшего  мухи,  которое  вызывает  висцеральный  лейшманиоз.

Первичный  скрининг.

Экстракты  изначально  тестировали  Leishmania  donovani  в  первичном  скрининге  дважды  при  80  мкг/мл,  и  процент  ингибирования  (%  инг.)  рассчитывали  по  отношению  к  отрицательному  и  положительному  контролю.  Извлечение,  показывающее  ≥  50  %  ингибирования,  изучали  на  вторичном  скрининге.

Вторичный  скрининг.  Все  образцы  тестировали  при  40,  8,0  и  1,6  мкг/мл  и  IC₅₀s  а  также  IC₉₀s  (тест  концентрациях,  что  дает  50  и  90  %  ингибирования  относительно  простейших  с  контрольной  группой,  соответственно).  Образцы,  которые  имели  IC₅₀  <1,6  мкг/мл  на  вторичном  скрининге  антилейшманиозной  активности,  передавали  на  третичный  анализ.  Все  IC₅₀s  и  IC₉₀s  рассчитывали  с  использованием  программного  обеспечения  XLfit.

Третичный  скрининг.  Образцы  повторно  тестировали  на  40,  8,  1,6,  0,32,  0,064,  0,0128  мкг/мл  и  IC₅₀s  и  IC₉₀s  пересчитывали  снова.  Все  IC₅₀s  и  IC₉₀s  рассчитывали  с  использованием  программного  обеспечения  XLfit.

В  результате  испытаний  установлено,  что  эфирное  масло  J.  sabina  в  отношении  L.  donovanii  в  исследуемых  дозировках  не  обладает  антилейшманиозной  активностью.

Таблица  2. 

Антилейшманиозная  активность  эфирного  масла  J.  sabina  L.  (первичный  скрининг)

*Концентрация  (mg/мл)  приводящая  к  50  %  ингибированию  роста

**  Концентрация  (mg/мл)  приводящая  к  90  %  ингибированию  роста

Таблица  3. 

Антилейшманиозная  активность  эфирного  масла  J.  sabina  L.  (вторичный  скрининг)

Изучение  антималярийной  активности  проводили  по  методике  описанной  нами  в  [12].

Как  видно  из  таблицы  4,  эфирное  масло  J.  sabina  оказывает  слабовыраженную  активность  в  отношении  Plasmodium  falciparum  D6.

Таблица  4.

Антималярийная  активность  эфирного  масла  J.  sabina  L.

Изучение  цитотоксической  активности  проводили  по  методике  описанной  нами  в  [16].

На  основании  проведенного  эксперимента  можно  предположить,  что  эфирное  масло  J.  sabina  во  всех  испытанных  концентрациях  проявляют  острую  летальную  токсичность  —  все  личинки  погибают  (таблицы  5—7),  что  согласуется  с  литературными  данными  [15].

Таблица  5. 

Цитотоксическая  активность  эфирного  масла  J.sabina  10  мг/мл

Таблица  6. 

Цитотоксическая  активность  эфирного  масла  J.  sabina  5  мг/мл

Таблица  7. 

Цитотоксическая  активность  эфирного  масла  J.  sabina  1  мг/мл

Для  получения  данных  по  доброкачественности  растительного  сырья  было  проведено  изучение  его  микроэлементного  состава.  Сырье  J.  sabina  собирали  в  июне  2011  г.  в  Павлодарской  области  с.  Баянаул  (лагерь  «Кристалл»)  Республики  Казахстан.

Проведено  сухое  озоление  сырья  J.  sabina.  Содержание  микроэлементов  определяли  методом  атомно-эмиссионной  спектрометрии  с  индуктивно-связанной  плазмой  на  приборе  ICP-AES  и  в  результате  которого  получены  количественные  данные  о  43  обнаруженных  элементах.

Таблица  8. 

Элементный  состав  золы  J.  sabina  L.

Для  стандартизации  и  выявления  строения  на  микроуровнях  ценного  растительного  сырья  (уточнения  локализации  эфирного  масла  в  надземных  органах)  J.  sabina,  мы  провели  изучение  его  анатомического  строения.

Материалы  и  методы.  Заготовку  сырья  J.  sabina  проводили  в  2—3  декадах  августа  в  фазе  плодоношения  в  горах  Улытау  (Улытауский  район,  Карагандинская  область,  Республика  Казахстан).

Исследовались  листья  (хвоя)  J.  sabina.  Воздушно-сухое  сырье  размачивали  в  горячей  воде  и  размягчали  в  смеси  глицерин-спирт-вода  дистиллированная  в  соотношении  1:1:1  [3,  6],  кипятили  в  5  %-ном  водном  растворе  гидроксида  калия.  Изготавливали  поверхностные  препараты  и  срезы  вручную.  Рисунки  выполняли  при  помощи  аппарата  РА-4М.  При  описании  анатомического  строения  использовали  принципы,  изложенные  в  трудах  В.Н.  Вехова,  Л.И.  Лотовой  [1,  5].

Анатомическое  строение.  На  поперечном  срезе  лист  имеет  овальное  строение.  Клетки  эпидермиса  состоят  из  1  слоя  клеток.  Эпидерма  покрыта  толстым  слоем  кутикулы.  Клетки  эпидермы  в  сечении  почти  квадратной  формы.  Все  стенки  сильно  утолщены,  в  углах  имеются  поровые  каналы.  Полость  клетки  округлая.  В  углублениях  на  уровне  гиподермы  расположены  устьица,  под  которыми  имеется  большая  воздушная  полость.  У  старых  листьев  стенки  клеток  эпидермы  одревесневают.

Под  эпидермой  находится  мезофилл,  состоящий  из  однородных  клеток,  стенки  которых  образуют  складчатую  структуру.  Это  значительно  увеличивает  площадь  прилегающего  к  стенке  слоя  цитоплазмы  с  хлоропластами,  а,  следовательно,  и  ассимилирующую  поверхность.  В  каждой  клетке  видно  ядро.

Смоляные  ходы,  пронизывающие  складчатую  паренхиму,  внутри  выстланы  тонкостенными  клетками,  выделяющими  внутрь  смолу,  а  снаружи  имеют  обкладку  из  толстостенных  клеток.

На  радиальных  стенках  клеток  эндодермы  имеются  одревесневающие  утолщения  –  пояски  Каспари.

Проводящие  пучки  коллатерального  типа.  Ксилемная  часть  обращена  к  плоской  стороне  листа,  флоэмная  —  к  выпуклой.  Следовательно,  плоская  сторона  хвои  является  морфологически  верхней,  а  выпуклая  —  нижней.  Между  проводящими  пучками  расположена  механическая  ткань  —  склеренхима.  Остальное  пространство  центральной  части  занято  толстостенными  паренхимными  клетками.

Рисунок  1.  Поперечный  срез  листа  J.  Sabina:  1  —  эпидермис,  2  —  устьице,  3  —  эндодерма,  4  —  смоляной  ход,  5  —  мезофилл,  5  —  флоэма,  6  —  ксилема

Таким  образом,  нами  проведено  изучение  антигрибковой,  антимикробной,  антилейшманиозной,  антималярийной  и  цитотоксической  активности  эфирного  масла  J.  sabina  L.,  определен  микроэлементный  состав  растительного  сырья  и  изучено  анатомическое  строение.

Список  литературы:

1.Вехов  В.Н.,  Лотова  Л.И.,  Филин  В.Р.  Практикум  по  анатомии  и  морфологии  высших  растений.  М.:  МГУ,  1980.  —  560  с.

2.Государственная  Фармакопея  СССР.  Вып.  2.  Общие  методы  анализа.  Лекарственное  растительное  сырье  МЗ  СССР.  11-е  изд.  М.,  1990.  —  400  с.

3.Долгова  А.А.,  Ладыгина  Е.Я.  Руководство  к  практическим  занятиям  по  фармакогнозии.  М.:  Медицина,  1977.  —  255  с.

4.Киханова  Ж.С.,  Искакова  Ж.Б.,  Джалмаханбетова  Р.И.,  Сейлханов  Т.М.,  Ross  S.A.,  Сулеймен  Е.М.  Компоненты  Artemisia  austriaca  Jacq.  и  их  биологическая  активность  //  Химия  природ.  соедин.  —  2013.  —  №  5.  —  P.  826—827.

5.Лотова  Л.И.  Ботаника:  Морфология  и  анатомия  высших  растений.  М.:  КомКнига,  2007.  —  512  с.

6.Прозина  М.Н.  Ботаническая  микротехника.  М.:  Высшая  школа,  1960.  —  206  с.

7.Флора  Казахстана.  Т.  7.  Алма-Ата:  Изд-во  АН  КазССР,  1964.  —  496  с.

8.Adams  R.P.,  Nguyen  S.,  Liu  J.  Geographic  Variation  in  the  Leaf  Essential  Oils  of  Juniperus  sabina  L.  and  J.  sabina  var.  arenaria  (E.H.  Wilson)  Farjon  //  Journal  of  Essential  Oil  Research.  —  2006.  —  №  18  (5).  —  P.  497—502.

9.Asili  J.,  Emami  S.A.,  Rahimizadeh  M.,  Fazly-Bazzaz  B.S.,  Hassanzadeh  M.K.  Chemical  and  Antimicrobial  Studies  of  Juniperus  sabina  L.  and  Juniperus  foetidissima  Willd.  Essential  Oils  //  Journal  of  Essential  Oil  Bearing  Plants.  —  2010.  —  №  13  (1).  —  P.  25—36.

10.Doosti  F.,  Bagherpasand  N.,  Zolfagharian  F.,  Sarabandi  S.,  Emami  S.,  Hassanzadeh  Khayyat  M.  Investigation  of  antioxidant  activity  of  the  essential  oils  of  different  parts  of  Juniperus  sabina  (Cupressaceae)  by  TBARS  method  in  comparison  with  vitamin  E  //  Research  in  Pharmaceutical  Sciences.  —  2012.  —  №  7(5).  —  S.  798.

11.Dweck  A.C.  Toxicology  of  essential  oils  reviewed  //  Personal  Care.  2009.  —  P.  65—77.

12.Emami  S.A.,  Shahidi  N.H.,  Hassanzadeh-Khayyat  M.  Antioxidant  activity  of  the  essential  oils  of  different  parts  of  Juniperus  sabina  L.  and  Juniperus  foetidissima  Willd.  (Cupressaceae)  //  International  Journal  of  Essential  Oil  Therapeutics.  —  2002.  —  №  3(4).  —  P.  363—370.

13.Pages  N.,  Fournier  G.,  Baduel  C.,  Tur  N.,  Rusnac  M.  Sabinyl  Acetate,  the  Main  Component  of  Juniperus  Sabina  L.  Essential  Oil,  is  Responsible  for  Antiimplantation  Effect  //  Phytotherapy  Research.  —  1996.  —  №  10  (5).  —  P.  438—440.

14.Pages  N.,  Fournier  G.,  Chamorro  G.,  Salazar  M.,  Paris  M.,  Boudene  C.  Teratological  evaluation  of  Juniperus  sabina  essential  oil  in  mice  //  Planta  Med.  —  1989.  —  №  55  (2).  —  P.  144—146.

15.Shokrzadeh  M.,  Azadbakht  M.,  Ahangar  N.,  Naderi  H.,  Saeedi  Saravi  S.S.  Comparison  of  the  cytotoxic  effects  of  Juniperus  sabina  and  Zataria  multiflora  extracts  with  Taxus  baccata  extract  and  Cisplatin  on  normal  and  cancer  cell  lines  //  Pharmacogn  Mag.  —  2010.  —  №  6  (22).  —  P.  102—105.

16.Suleimenov  E.M.  Components  of  Peusedanum  morisonii  and  their  antimicrobial  and  cytotoxic  activity  //  Chemistry  of  Natural  Compounds.  —  2009.  —  №  45  (5)  —  P.  710—711.

17.Suleimenov  Ye.M.,  Atazhanova  G.A.,  Kulyjasov  A.T.,  Ozek  T.,  Demirchi  B.,  Adekenov  S.M.,  Baser  K.H.C.  Constituents  of  Juniperus  sabina  essential  oil  from  Kazakhstan  /  4^th  Internat.  Symposium  on  the  chemistry  of  natural  compounds,  Isparta,  Turkey.  2001.  —  P.  93.