ИССЛЕДОВАНИЕ  СЪЕДОБНЫХ  ГРИБОВ  В  КАЧЕСТВЕ  ПРОДУЦЕНТОВ  ЛИГНОЛИТИЧЕСКИХ  ФЕРМЕНТОВ

Ковальногих  Екатерина  Леонидовна

аспирант  Вятского  государственного  университета,  г.  Киров

E-mail: 

Шевченко  Елена  Александровна

аспирант  Вятского  государственного  университета,  г.  Киров

E-mail:  shevchenko7000@mail.ru

Бессолицына  Екатерина  Андреевна

канд.  биол.  наук,  доцент  Вятского  государственного  университета,  г.  Киров

E-mail: 

Дармов  Илья  Владимирович

д-р  биол.  наук,  профессор,  начальник  кафедры  микробиологии  Вятского  государственного  университета,  г.  Киров

E-mail: 

В  медицине  и  косметологии  большое  значение  имеет  получение  биологически  активных  веществ  (витаминов,  убихинонов,  ферментов,  антиоксидантов,  и  др).  Высшие  базидиальные  грибы  служат  источником  таких  веществ,  что  выдвигает  их  на  первый  план  в  качестве  дешевого  сырья  для  получения  фармакологически  ценных  компонентов  [1,  с.  196;  4,  с.  8].

В  настоящее  время  в  медицинскую  и  косметологическую  практику  внедряются  различные  композиции  из  экстрактов  плодовых  тел  грибов  и  их  мицелия.  Гетерополисахариды  используются  в  качестве  иммунокорректоров  (трутовик  плоский  (Ganoderma  applanatum)),  хитин,  глюканы  и  меланин  -  в  качестве  сорбентов  (трутовик  настоящий  (Fomes  fomentarius)).  Но  использование  несъедобных  грибов  в  качестве  продуцентов,  требует  сложной  проверки  получаемых  препаратов  на  токсичность  и  аллергогенность  [3,  с.  253;  5,  с.  75;  6,  с.  266].

В  связи  с  этим  актуально  получение  заведомо  нетоксичных  препаратов  ферментов  и  других  биологически  активных  веществ.  Эта  проблема  может  быть  решена  внедрением  в  производство  съедобных  грибов  как  источников  ценных  фармакологических  веществ.

В  данном  исследовании  оценивалась  возможность  получения  из  съедобных  грибов  отбеливающего  косметического  препарата  ферментов  лигнолитического  комплекса.  У  грибов  определялось  наличие  трех  ферментов:  лакказы,  лигнинпероксидазы  и  марганецпероксидазы.

Для  исследований  было  отобрано  7  видов  съедобных  грибов:  белый  гриб  березовый  (Boletus  betulicola),  подосиновик  красный  (Leccinum  aurantiacum),  подберезовик  обыкновенный  (Leccinum  scabrum),  масленок  обыкновенный  (Suillus  luteus),  рыжик  настоящий  (Lactarius  deliciosus),  вешенка  обыкновенная  (Pleurotus  ostreatus),  опенок  осенний  (Armillaria  mellea)  .

На  первом  этапе  исследования  определяли  наличие  генов  лигнолитического  комплекса  в  геноме  базидиальных  грибов,  используя  метод  ПЦР  [2,  с.  134].  По  результатам  ПЦР  -  анализа  сделан  вывод,  что  белый  гриб  березовый,  рыжик  настоящий,  вешенка  обыкновенная,  опенок  осенний  содержат  в  своем  геноме  гены  всех  трех  лигнолитических  ферментов.  Однако  у  них  возможно  наличие  нетранскрибируемых  генов,  поэтому  на  втором  этапе  исследований  выявляли  экспрессию  генов  по  наличию  РНК  методом  обратной  транскрипции  (ОТ-ПЦР). 

По  результатам  ОТ-ПЦР  было  установлено,  что  у  белого  гриба  березового  экспрессируются  гены  лакказы  (фрагменты  450  и  200  п.  н.).  ПЦР  анализ  показал  наличие  генов  трех  изоформ  фермента  (150,  200  и  300  п.  н.),  но  экспрессируется  из  них  только  один.

У  вешенки  обыкновенной  экспрессируеются  гены  лакказы  и  лигнинпероксидазы.  При  этом  из  обнаруженных  в  результате  ПЦР  трех  генов  лакказы  (210,  250  и  300  п.  н.)  экспрессируется  только  один  (обнаружена  кДНК  размером  210  п.  н.).  Из  двух  генов  лигнинпероксидазы  (180  и  300  п.  н.)  экспрессируется  также  один  (150  п.  н.).

У  опенка  экспрессируются  только  гены  лигнинпероксидазы.  При  этом  ПЦР-анализ  выявил  наличие  фрагмента  200  п.  н.,  а  с  использованием  ОТ-ПЦР  была  обнаружена  кДНК  размером  150  п.  н.,  что  свидетельствовало  о  наличии  интронов  в  данном  гене.

У  рыжика  настоящего  экспрессируются  все  три  фермента  лигнинолитического  комплекса:  лакказы  (180,  210  п.  н.),  лигнин  пероксидаза  (200  п.  н.)  и  марганец-зависимая  пероксидаза  (250  п.  н.).  При  этом  несоответствие  размеров  продуктов,  полученных  в  результате  ПЦР  и  ОТ-ПЦР  свидетельствуют  о  наличии  интронов  в  данных  генах. 

После  двух  этапов  исследования  рыжик  настоящий  был  признан  наиболее  перспективным  для  практического  применения.  На  следующем  этапе  работы  этот  гриб  был  выделен  в  мицелиальную  культуру.  В  полученном  мицелии  измеряли  активность  ферментов  лигнолитического  комплекса  колориметрическими  методами.  Для  этого  мицелий  культивировали  в  жидкой  модифицированной  среде  Чапека-Докса,  содержащей  индукторы  синтеза  ферментов,  опил  и  глюкозу.  Питательная  среда  использовалась  в  трех  вариантах,  с  содержанием  глюкозы  10,  20,  30  г  на  литр.  Каждые  5  суток  проводился  отбирали  5  мл  культуральной  жидкости,  в  которой  спектрофотометрически  определяли  активность  ферментов  при  добавлении  соответствующих  субстратов.

Для  каждой  реакции  проводили  регистрацию  зависимости  поглощения  раствора  от  времени  реакции  при  длине  волны,  соответствующей  максимуму  поглощения  продукта  данной  реакции  (для  лигнинпероксидазы  —  436  нм,  лакказы  —  410  нм,  марганецпероксидазы  —  238  нм). 

Наибольшую  удельную  активность  лигнинпероксидазы  (79,6  е.  а/мл)  наблюдали  на  15  сутки  культивирования  в  среде,  содержащей  30  г  глюкозы.  В  среде,  содержащей  20  г  сахара  максимальная  удельная  активность  составила  68,1  е.  а/мл.  Понижение  содержания  глюкозы  до  10  г/мл  привело  к  снижению  удельной  активности  лигнинпероксидазы  до  38  е.  а/мл.  При  культивировании  у  данного  фермента  был  выявлен  только  один  пик  удельной  активности

При  измерении  удельной  активности  лакказы  было  выявлено  наличие  двух  пиков  —  на  15  и  25  сутки  культивирования.  Появление  второго  пика  связано  с  накоплением  так  называемых  «медленных»  лакказ.  На  15  сутки  в  среде  с  содержанием  глюкозы  30  г/л  выявлена  удельная  активность  лакказ  13  е.  а/мл,  20  г/л  —  16,9  е.  а/мл  (максимальное  значение),  10  г/л  —  10,2  е.  а/мл.  На  25  сутки  культивирования  максимальная  удельная  активность  лакказы  составила  15,4  е.  а/мл  (в  среде  20  г  глюкозы  на  1  л).  В  среде  с  содержанием  сахара  30  г/л  —  14,5  е.  а/мл,  10  г/л  —  10,8  е.  а/мл.

Исследования  марганецпероксидазы  показали,  что  максимальная  удельная  активность  этого  фермента  (7,4  е.  а/мл)  приходится  на  15  сутки  культивирования  в  среде,  содержащей  10  г  глюкозы.  В  питательной  среде  с  содержанием  глюкозы  30  г  удельная  активность  марганецпероксидазы  составила  4,1  е.  а/мл,  с  20  г  глюкозы  —  6,6  е.  а/мл.  Был  детектирован  один  пик  маганецпероксидазной  активности. 

Дальнейшие  исследования  будут  направлены  на  оптимизацию  условий  культивирования  грибного  мицелия  и  повышение  выхода  лигнолитических  ферментов.

Список  литературы:

1. Заикина  Н.А.  Основы  биотехнологии  высших  грибов:  учеб.  пособие  для  студ.  обуч.  по  напр.  Биология.  М.:  Проспект  науки,  2007.  —  336  с.
2. Изучение  экспрессии  генов  лигнолитического  комплекса  у  съедобных  грибов  /  Е.Л.  Ковальногих  [и  др.]  //  Всероссийская  ежегодная  научно  —  техническая  конференция  «Общество,  наука,  инновации»  (НТК  —  2012):  сборник  материалов:  Вятский  гос.  ун-т.,  Киров,  2012. 
3. Кожемякина  Н.В.,  Афанасьева  Е.П.,  Гурина  С.В.  Иммуностимулирующая  активность  мицелия  некоторых  базидиомицетов  //  Иммунопатология.  Аллергология.  Инфектология.  —  2010.  —  №  1.  —  С.  253—254.
4. Кутафьева  Н.П.  Морфология  грибов:  учеб.  пособие  для  студ.  вузов,  общ.  по  спец.  Биология:  доп.  М-вом  образов.  Р.Ф.  —  2-е  изд.  исп.  и  доп.  —  Новосибирск:  Сиб.  унив.  изд-во,  2003.  —  215  с.
5. Огарков  Б.Н.,  Огаркова  Т.Р.,  Салусенок  Л.В.  Микро-  и  макромицеты  как  основа  биотехнологических  препаратов  //  Известия  Иркутского  государственного  университета.  Серия:  Биология.  Экология.  —  2010.  —  Т.  3,  №  2.  —  С.  75—86.
6. Сенюк  О.Ф.,  Курочко  Н.Ф.,  Горовой  Л.Ф.  Использование  грибного  препарата  микотон  в  лечении  пациентов  //  Иммунопатология.  Аллергология.  Инфектология.  —  2010.  —  №  1.  —  С.  266—267.