АКТИВНОСТЬ ИНТЕРФЕРОН-ЗАВИСИМОЙ 2',5' ОЛИГОАДЕНИЛАТ СИНТЕТАЗЫ В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ ТИМУСА И СЕЛЕЗЕНКИ КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Войтенко Валерия Владимировна

аспирант, Киевский Национальный Университет им. Т. Шевченко, УНЦ «Институт биологии», г. Киев

Компанец Ирина Владимировна

канд. биол. наук, доцент, Киевский Национальный Университет им. Т. Шевченко, УНЦ «Институт биологии», г. Киев

Гадилия Алена Петровна

инженер 1-ой категории, Киевский Национальный Университет им. Т. Шевченко, УНЦ «Институт биологии», г. Киев

Билюк Анастасия Александровна

студент, Киевский Национальный Университет им. Т. Шевченко, УНЦ «Институт биологии», г. Киев

Остапченко Людмила Ивановна

д-р биол. наук, профессор, Киевский Национальный Университет им. Т. Шевченко, УНЦ «Институт биологии», г. Киев

E-mail: vvvoitenko@yahoo.com

Одним из самых распространенных заболеваний в мире является алкоголизм. Этанол вызывает серьезные изменения метаболизма кле­ток: нарушает структуру мембран, что приводит к дестабилизации функционирования ферментных каскадов [1]. Имея высокую химичес­кую активность, этанол вступает во взаимодействия с природними соединениями, изменяет и тормозит функционирование биохимичес­ких процессов, истощает ферментативные системы, тем самым нега­тивно влияя на состояние отдельных органов и систем и, как следст­вие, всего организма в целом.

На уровне организма наиболее чувствительна к повреждающему действию алкоголя иммунная система [8]. Установлено, что этанол вызывает дисбаланс продукции про- и противовоспалительных цито­кинов, что приводит к возникновению нарушений в сигнальной транс­дукции в лимфоидных клетках [11]. У больных хроническим алкого­лизмом снижается устойчивость к вирусным заболеваниям (например, к гепатиту С) и возникает хронический воспалительный процесс [12].

Интерферон (ИФН) является одним из основных цитокинов, которые принимают участие в развитии иммунного ответа [6]. Его действие на клетки опосредуется целым рядом сигнальных систем, в частности системой 2',5'-олигоаденилата (2',5'-ОА). Она принимает участие в антивирусной и антипролиферативной защите, иммунной активации, апоптозе, реакции на воспаление [13]. Ключевой фермент этой системы - 2',5'-олигоаденилат-синтетаза (2',5'-ОАС), которая син­тезирует регуляторную молекулу 2',5'-ОА. Это приводит к активации латентной в обычных условиях эндорибонуклеазы, котроя способна разрушать вирусные и клеточные РНК.

Широко изучаются биохимические процессы, возникающие при хроническом действии алкоголя на иммунную систему [8], но остается малоизученной роль системы 2',5'-ОА, индуцируемой интерфероном. Целью данной работы было изучить активность 2',5'-ОАС в клетках лимфоидных органов (селезенки и тимуса) крыс на модели хрони­ческой алкогольной интоксикации, вызванной 28-дневным введением этанола.

Материалы и методы:

Исследования проводили на белых беспородных крысах (самцах) массой 180—200 г, которые содержались на стандартном рационе вивария с свободным доступом к воде. Робота с животными была про­ведена в соответствии с международными рекомендациями по прове­дению медико-биологических исследований. Животные были поделе­ны на 2 группы. 1-я группа — контрольные животные; 2-я группа — крысы с хронической алкогольной интоксикацией, которая вызывалась по стандартной методике М. Х. Халилова и Ш. А. Закирходжаева; путем перорального 28-дневного введения крысам 40 %-го раствора этанола из расчета 2 мл на 100 г массы животного раз в сутки [4]. Животных декапитировали на 14, 21 и 28-е сутки эксперимента и выделяли селезенку и тимус. Лимфоциты селезенки и тимуса получали путем центрифугирования клеточной суспензии в градиенте Ficoll-Paque (плотность 1,077) по методике [5]. Клетки замораживали в жидком азоте с последующим размораживанием и центрифугирова­нием со скоростью 10000 g в течение 15 минут для получения кле­точной фракции (супернатант) [10]. Активность 2',5-ОАС определяли спектрофотометрическим методом соответственно [9] по количеству неорганического пирофосфата (РРн), который является одним из про­дуктов синтеза 2',5'-олигоаденилата из АТР под действием 2',5' ОАС. Активность энзима выражали в наномолях РРн за 1 мин на 1 мг белка.

Результаты и обсуждение:

Действие этанола на иммунную систему существенно и прояв­ляется, в первую очередь, в снижении иммунитета в целом. Иммунный ответ при алкоголизации организма, может проявляться в нарушении каскадов сигнальной трансдукции, в которой принимают участие боль­шое количество вторичных посредников [8]. Влияние алкоголя на ин­дуцируемую ИФН систему 2′,5′-олигоаденилата, изучено недостаточно.

В данной работе изучалась активность ключевого фермента сиг­нальной системы интерферона — 2',5'-олигоаденилат-синтетазы в лимфоцитах и тимоцитах крыс при хронической алкогольной инток­сикации. Также было изучено влияние этанола на активность этого фермента на фоне действия индуктора ИФН — циклоферона. Циклоферон (10-карбоксилметил-9-акриданон) индуцирует в лимфо­цитах синтез ИФН-a и эффективно используется для лечения вирус­ных заболеваний [2].

Анализ полученных данных показал, что введение крысам этано­ла в течение 14-ти суток приводит к снижению активности 2',5'-ОАС в лимфоцитах селезенки на 78 % относительно уровня контроля (рис. 1,1). На 21-е сутки эксперимента активность исследуемого фермента снижалась на 67 %, а на 28-е сутки — на 42 % относительно контроля. Инкубация изолированных из селезенки лимфоцитов с индуктором ин­терферона — циклофероном in vitro приводила к возрастанию актив­ности фермента относительно таковой в клетках, которые с препара­том не инкубировались. В лимфоцитах крыс контрольной группы активность 2',5'-ОАС увеличивалась на 281 %; в клетках животных, которым вводили этанол в течение 14, 21 и 28 суток, активность возрастала на 229 %, 239 % и 242 % соответственно. Это свидетельст­вует о том, что при действии алкоголя угнетается индуцированная циклофероном стимуляция активности данного фермента. Выявлен­ный эффект угнетения стимуляции активности прямо пропорционален снижению активности фермента на разных сроках введения этанола.

Изучение влияния введения этанола на лимфоциты тимуса крыс показало, что активность 2',5'-ОАС на 14-е, 21-е и 28-е сутки экспе­римента уменьшалась на 75 %, 57 % и 31 % соответственно (рис. 1, 2). Индуцированная циклофероном in vitro активность фермента в изоли­рованных лимфоцитах тимуса крыс контрольной группы возрастала на 292 %, а на 14-е, 21-е и 28-е сутки введения этанола она увеличивалась на 257 %, 262 % и 274 % соответственно, что сопоставимо с данными, полученными при изучении активности 2',5'-ОАС в лимфоцитах селезенки.

Таким образом, мы показали, что при хронической алкогольной интоксикации снижается активность интерферон-зависимого фермен­та — 2',5'-ОАС в лимфоцитах селезенки и тимуса крыс. Для клеток обоих лимфоидных органов наблюдается подобная тенденция изменений активности 2',5'-ОАС: ее значения минимальны на 14-сутки введения этанола, на более поздних сроках (21-е и 28-е сутки) она возрастает, но не достигает уровня нормы. При действии этанола угнетается стимуляция активности 2',5'-ОАС в ответ на действие индуктора ИФН — циклоферона in vitro. При этом изменения активности аналогичны наблюдаемым в клетках, необработанных индуктором. Причиной снижения активности 2',5'-ОАС может быть подавление синтеза лимфоцитами ИФН, вызванное продолжительным действием этанола. В пользу этого предположения может свидетельст­вовать выявленная корреляция между снижением активности фермен­та и угнетением стимуляции его активности в ответ на действие индуктора.

Из данных литературы известно, что при алкоголизме значи­тельно повреждается иммунная система, в частности, нарушается про­дукция цитокинов иммунокомпетентными клетками [11]. Также пока­зано, что при продолжительном употребления алкоголя ослабевает способность лейкоцитов крови людей к продукции интерферона в ответ на действие его индукторов іn vitro — фитогемиглютинина А и конканавалина А [7].

1

2

Рис. 1. Активность 2′,5′-аденилат-синтетазы в лимфоцитах селезенки (1) и тимуса (2) крыс при введении этанола

Лимфоциты, выделенные из селезенки и тимуса крыс, инкубиро­вались in vitro с индуктором интерферона — циклофероном (в концентрации 100 мкг/мл на 5×10⁶ клеток/мл)

* — Р≤0,05 относительно контроля (клетки интактных животных),

# —Р≤0,05 относительно клеток, которые не инкубировались с циклофероном

Следовательно, недостаток этого цитокина у людей больных хро­ническим алкоголизмом приводил к развитию нарушений иммунной системы, поскольку он имеет ключевое значение в реализации иммун­ного ответа.

Этанол вызывает в клетках ярко выраженный оксидативный стресс, проявляющийся в дестабилизации клеточных мембран, а в результате изменение конформации мембранных рецепторов и потеря их способности взаимодействовать с лигандами [3]. Из этого может следовать, что под влиянием этанола также может угнетаться передача сигнала в системе интерферона в лимфоцитах, в результате чего активность исследуемого нами фермента снижается.

Повышение активности 2',5'-ОАС на более поздних стадиях развития алкогольной интоксикации (21-е, 28-е сутки), в сравнении с более ранней (14-е сутки) можно объяснить развитием компенса­торных процессов в лимфоцитах селезенки и тимуса, вследствие чего синтез интерферона может усиливается.

Изучение функционирования интерферон-зависимой системы 2',5'-ОА при хронической алкогольной интоксикации важно для выяс­нения механизмов развития иммунного ответа при алкоголизме, а так­же поиска новых путей коррекции состояния иммунной системы при этой патологии.

Список литературы:

1. Дереча Л. М. Алкоголь и его действие на организм: обзор литературы // Вестник Харковського национального университета. — 2007. — Вып. 6. — № 788.—C. 7—16.
2. Коваленко А. П., Казаков В. И., Слита А. В. Исследование внутриклеточной локализации циклоферона, связывания его c ДНК и стимуляции экспрессии цитокинов в клетках при воздействии циклоферона // Цитология. — 2000. — т. 42, № 7. — С. 659—663.
3. Семина И., Файзуллин Д., Ступишина Е. Антиалкогольная активность ноотропных препаратов и физические свойства биомембран // Структура и динамика молекулярных систем. — 2003. — вып. X, ч. 2. — С. 246—249.
4. Халилов М. Х., Закихорджаев Ш. Я. К характеристике некоторых патохимических сдвигов в крови, тканях печени и головного мозга при экспериментальной алкогольной интоксикации // Вопросы клиники алкоголизма: Сб. науч. тр., Ташкент, 1983. — С. 38—41.
5. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow // Scand. J.Clin. Lab. Invest. - 1968. - v. 21. - P. 28—30.
6. Content J. Mechanisms of induction and action of interferons // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 2009. - 71, № 1-2. - P. 51—71.
7. Daniluk J., Kandefer-Szerszeń M. Interferon production by peripheral blood cells of patients with alcoholic liver disease (ALD) // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz).—1994.—v. 42, № 3. — P. 231—238
8. Goral J., Karavitis J., Kovacs E. J. Exposure-dependent effects of ethanol on the innate immune system // Alcohol. - 2008. - v. 42, No. 4. — 237—247.
9. Justensen J., Kjeldgaard N. O. Spectrophotometric pyrophosphate assay of 2',5'-oligoadenylate synthetase // Anal. Biochem. - 1992.—v. 207, № 1. - Р. 90—93.
10. Mechti N., Affabris E., Romeo G. et al. Role of interferon and 2',5'-oligoadenylate synthetase in erythroid differentiation of Friend leukemia cells // J. Biol. Chem. — 1984. — v. 259, № 5. - P. 3261—3265.
11. Redwine L., Dang J., Hall M., Irwin M. Disordered Sleep, Nocturnal Cytokines, and Immunity in Alcoholics // Psychosomatic Medicine. — 2 003. — v. 65. — P. 75—85.
12. Song K., Coleman R. A., Zhu X., et al. Chronic ethanol consumption by mice results in activated splenic T cells // Journal of Leukocyte Biology. — 2002. — v. 72. — P. 1109—1116.
13. Takaoka A., Yanai H. Interferon signalling network in innate defence // Cellular Microbiology. — 2006. — 8, № 6. — P. 907—922.