Влияние нитратов на неврологический дефицит крыс, вызванный экспериментальной ишемией мозга

Кузенков Виктор Сергеевич

канд. биол. наук, лаборант-инженер I-категории МГУ, г. Москва

Е-mail: kouzenkov@mail.ru

Курилина Татьяна Андреевна

Старший лаборант МГУ, г. Москва

E-mail:

В настоящее время показано, что анионы нитрата (NO₃^-) и нитрита (NO₂^-) присутствующие в организме и которые ранее считали инертными конечными продуктами метаболизма оксида азота (NO), обладают фармакологическими свойствами [12]. До начала XX века нитраты и нитриты были терапевтическими средствами, используемыми в лечении стенокардии, гипертонии и других заболеваний, но были заменены нитроглицерином [7]. После того, как появились сообщения, что нитраты и нитриты могут быть ответственны за карциогенез и метгемоглобинию (особенно у детей), наступил период “нитратофобии” [5, 6]. Теперь вновь появилось большое количество исследований, в которых показана протекторная роль этих субстанций на различные органы организма, особенно в гипоксически/ишемических условиях [1, 9]. Нитраты и нитриты сейчас рассматривают как форму хранения NO, а не инертных ненужных продуктов.

Восстановление нитратов и нитритов до вазоактивного оксида азота (NO) осуществляется как ферментативным, так и неферментативным путем [11]. Оксид азота, полученный из нитратов и нитритов, представляет важный альтернативный источник NO в классическом пути L-arginine-NO-synthase, особенно в ишемически/гипоксических условиях, когда система NOS/L-аргинин повреждена или недостаточно активна. Восстановление нитрита к NO может произойти различными путями, вовлекающими ферменты, белки, витамины или даже простые протоны [8]. Таким образом, NO может образовываться не только из L-аргинина (классический путь NOS/L-аргинин), но также из ионов NO₂¯, которые восстанавливаются в NO при участии гемсодержащих белков. Ионы NO_2,¯ в свою очередь, могут образовываться в ходе восстановления ионов NO₃¯ под действием металл-содержащих ферментов (ксантиноксидоредуктазы, метгемоглобин и т. п). Особенно интенсивно превращения нитратов в нитриты и NO (NO₃¯ → NO₂¯ → NO) осуществляется в условиях гипоксии [2].

Выше было отмечено, что интенсивное превращение нитратов в нитриты и NO осуществляется в условиях гипоксии/ишемии, которые активируют нитрат/нитритредуктазы. Но, на активность нитрат/нитритредуктаз влияют также катионы моновалентных и двухвалентных металлов, сопутствующие аниону. Падение нитратредуцирующей активности отмечено в ряду: K⁺, Na⁺, Mg₂⁺, Ca₂⁺, Ba₂⁺ [4].

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение влияния нитрата калия (КNO₃) и нитрата магния (Mg(NO₃)₂) на динамику неврологических нарушений и смертность животных в результате ишемии мозга, вызванной двухсторонней окклюзией общих сонных артерий. КNO₃ и Mg(NO₃)₂ вводились внутрибрюшинном за 60 минут до окклюзии 2-х сонных артерий в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг.

Материалы и методы исследований

В опытах использовали самцов крыс линии Wistar массой 110—140 г. Все группы животных составляли крысы с неполной глобальной ишемией мозга. Для создания дефицита кровоснабжения мозга применяли классическую модель неполной глобальной ишемии, вызванной одномоментной двусторонней перевязкой общих сонных артерий [3]. Крысам под эфирным наркозом отсепаровывали и перевязывали общие сонные артерии. Первой (KNO₃-5), n=29, и второй (KNO₃-50), n=29, опытным группам вводили нитрат калия (KNO₃) в дозе 5 мг/кг и 50 мг/кг (соответственно) внутрибрюшинно за 60 минут перед окклюзией 2-х сонных артерий. Третьей (Mg(NO₃)₂-5), n=29, и четвертой (Mg(NO₃)₂-50), n=29, опытным группам крыс вводили нитрат магния в дозе 5 мг/кг и 50 мг/кг (соответственно) внутрибрюшинно за 60 минут до окклюзии 2-х сонных артерий. Контрольным животным (контроль), n=29, вводили физиологический раствор (0,9 % NaCl) в эквивалентном количестве. Длительность операции составляла не более 10 мин, затем крысы быстро восстанавливались после эфирного наркоза. После операции животных помещали в отдельные клетки и визуально оценивали динамику развития неврологического дефицита в баллах по методике бальной оценки неврологического состояния крыс после двухсторонней перевязки общих сонных артерий [10]. Основные признаки неврологических нарушений включали ограничение подвижности животного, птоз, гиперактивное поведение, насильственные движения (вращения, прыжки, судорожные и вращательные припадки), парезы конечностей, кому и смерть. По шкале бальной оценки легкая степень неврологической симптоматики составляет 0—3 баллов (состояние, близкое к норме); средняя степень – 3—6 баллов; тяжелая степень 7—24 балла; 25 баллов – смерть. Неврологический дефицит отдельно взятого животного оценивали через каждые 30 мин в течение 8часов. Суммарный балл неврологического дефицита по каждому промежутку времени усредняли для всех животных в группе. На основе полученных данных строили графики динамики неврологических нарушений, отложив по оси ординат баллы, по оси абсцисс – время. Оценку летальности проводили по гистограммам, отражающим процент выживших и умерших животных. Для статического анализа полученных данных по динамике неврологического дефицита использовали непараметрический тест Манна-Уитни с использованием компьютерной программы “Statistika 6”. Для оценки летальности неврологических проявлений применяли критерий Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение

У животных, которым вводили KNO₃ в дозе 5мг/кг, наблюдалось достоверное (p<0,01) снижение неврологического дефицита по сравнению с контрольными крысами на временном интервале 300—480 мин. (рис. 1). Напротив, у крыс, которым вводили KNO₃ в дозе 50 мг/кг, наблюдалось достоверное (p<0,05) увеличение неврологической симптоматики по сравнению с контрольными крысами на временном интервале 330—480 мин. (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние KNO₃ на развитие неврологических нарушений при неполной глобальной ишемии мозга. * p<0,05 – достоверность различий между группами KNO₃-50 и контроль, + p<0,01 достоверность различий между группами KNO₃-5 и контроль.

Рисунок 2. Влияние Mg(NO3)2 на развитие неврологических нарушений при неполной глобальной ишемии мозга. * p<0,05 – достоверность различий между группами Mg(NO3)2-50 и контроль.

На рис.2 видно, что нитрат магния Mg(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг не оказал сколько-нибудь существенного влияния на динамику неврологических нарушений у крыс. Внутрибрюшинное введение Mg(NO₃)₂ в дозе 50 мг/кг вызвало достоверное (p<0,05) ухудшение неврологической симптоматики на интервале 300—480 мин. (рис.2).

Известно, что окклюзия двух сонных артерий вызывает развитие острой церебральной ишемии и запускает каскад патобиохимических реакций в головном мозге, вызывая повреждения нейронов и глии [3]. Нитраты-нитриты представляют распространенный химический пул биодоступности NO в сосудистой системе и тканях [1, 8, 11]. Этот пул (нитрат-нитрит-NO) присутствует в организме даже при жесткой без нитрат/нитритной диете [12]. В условиях пониженного содержания кислорода и ацидоза, сопровождающие ишемию мозга многие энзимы изменяют «профиль» своей обычной ферментативной активности. [1, 8, 11]. При ишемически/гипоксических условиях возрастает активность нитрат/нитрит редуктаз осуществляющих цепь превращений NO₃¯ → NO₂¯ → NO.

Исходя из выше изложенного, результаты эксперимента можно объяснить следующим образом. Отсутствие протекторного влияния Mg(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг, по всей видимости, связана со слабой активностью нитрат/нитрит редуктаз в присутствии катиона Mg²⁺ по сравнению с катионами K⁺ (рис. 2).

Значительное протекторное влияние на ишемию мозга KNO₃ в дозе 5 мг/кг (рис.1) вероятно связано с усилением редукции нитратов и нитритов до NO, что способствуют повышению кровотока и других протекторных эффектов, связанных с NO или NO-модифицированными протеинами и липидами [1, 11, 9]. Поскольку активность нитрат/нитрит редуктаз зависит от типа катиона, входящего в состав нитрат/нитрит редуктаз, то защитное воздействие КNO₃ можно объяснить тем, что активность нитрат/нитрит редуктаз, в присутствие катиона K⁺ выше, чем в присутствие катиона Mg²⁺ [4].

Усиление повреждающего действия КNO₃ в дозе 50 мг/кг на неполную глобальную ишемию мозга (рис. 1), по всей видимости, связано с высокой нитрат/нитрит редуцирующей активностью катиона К⁺, что приводит к гиперпродукции оксида азота. Известно, очень высокая концентрация NO приводит к усилению повреждающего эффекта ишемического инсульта. Увеличение ишемически/гипоксических повреждений и смертности, связанные с Mg(NO₃)₂, взятым в дозе 50 мг/кг, вероятно, связаны как с гиперпродукцией NO, так и другими отрицательными эффектами Mg²⁺-содержащих ферментов.

Таким образом, полученные данные показывают, что исследованные нитраты КNO₃ и Mg(NO₃)₂ в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг, оказывают неодинаковый и даже разнонаправленный эффект на неврологические нарушения у крыс. В целом полученные результаты подтверждают представление как о протекторном, так повреждающем влиянии нитратов на сосудистую систему мозга.

Список литературы:

1.            Крушинский А. Л., Кузенков В. С., Дьяконова В. Е., Реутов В. П. Влияние ингибиторов индуцибельной и нейрональной NO-синтаз на развитие аудиогенных стрессорных повреждений у крыс линии Крушинского—Молодкиной. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2010. Т. 150. № 7 — С. 38 —41.

2.            Реутов В. П., Сорокина Е. Г., Охотин В. Е., Косицин Н. С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М: Наука, 1997. 156 с.

3.            Саркисов К. Ю., Опиц Б., Оеме П. Влияние фрагмента субстанции Р. (3—4) на течение ишемии мозга у крыс с разным типом поведения // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1996. 121. № 4. с. 399—403.

4.            Храмов В. А., Комарова В. И., Темкин Э. С. Антибиотики как ингибиторы нитратредуктазы ротовой жидкости человека // Стоматология. 2000. № 2. с. 4—5.

5.            Knekt P, Järvinen R, Dich J, Hakulinen T. Risk of colorectal and other gastro-intestinal cancers after exposure to nitrate, nitrite and N-nitroso compounds: a follow—up study. Int J Cancer. 1999. V. 80(6). P. 852—6.

6.            Manassaram D. M., Backer L. C., Moll D. M.. A Review of Nitrates in Drinking Water: Maternal Exposure and Adverse Reproductive and Developmental Outcomes. Environ Health Perspect. 2006. V. 114(3). P. 320—327.

7.            Mayer B, Beretta M. The enigma of nitroglycerin bioactivation and nitrate tolerance: news, views and troubles. Br. J. Pharmacol. 2008. V. 155(2). P. 170—184.

8.            Millar T. M., Stevens C. R., Benjamin N., Eisenthal R., Harrison R., Blake D. R. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Lett. 1998. V. 427. P. 225—228.

9.            Okamoto M., Tsuchiya K., Kanematsu Y., Izawa Y., Yoshizumi M., Kagawa S., Tamaki T. Nitrite-derived nitric oxide formation after ischemia-reperfusion injury in kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2005. V. 288. F 182—F 187.

10.       Tsai A. G., Jonson P. C., Intglietta M. Oxygen Gradients in the Microcirculation Physiol Rev. 2003. V. 83(3) P. 933—963.

11.       Weitzberg E., Hezel M., Lundberg J. O. Nitrate-nitrite-nitric oxide pathway: implications for anesthesiology and intensive care. Anesthesiology. 2010 V. 113(6). P. 1460—75.

12.       Zweier J. L., Li H., Samouilov A., X. Liu. Mechanisms of Nitrite Reduction to Nitric Oxide in the Heart and Vessel Wall. Nitric Oxide. 2010. V. 22(2). P. 83—90.