ГЛЮКОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ ЛЕГИОНЕЛЛ

Совкова Ирина Владимировна

аспирант, ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, г. Москва

E-mail:

">irinka.tabakova@mail.ru

Легионеллы являются инфекционными агентами тяжелого легочного заболевания человека – болезни легионеров (легионеллез). Данные бактерии обладают способностью размножаться в эукариотических клетках, таких как макрофаги, моноциты и эпителиальные клетки. С точки зрения субклеточного расположения легионеллы являются «вакуолярными» патогенами, то есть размножаются внутри фагосомы. Этому предшествуют характерные изменения вакуоли с находящимися в ней бактериями и приводящими к превращению органеллы в удобную нишу для размножения микроорганизмов. Наряду с изменением процессов биогенеза фагосомы в эукариотической клетке наблюдаются и иные процессы, вызванные специфическими активностями возбудителями и, по-видимому, способствующие его внутриклеточному размножению. К этим изменениям относятся изменение про-и антиапоптотического равновесия, нарушение процессов убиквитинизации белков, нарушение синтеза белка и др. Все перечисленное указывает на сложный и многогранный характер взаимодействия легионелл и клетки-мишени [9].

С целью исследования молекулярной природы наблюдающихся многочисленных нарушений в эукариотических клетках были проведены опыты по выявлению глюкозилирующей активности в культурах легионелл. В этих экспериментах было установено, что экстракты, полученные из вирулентных легионелл, обладали глюкозилирующей активностью и приводили к модификации ~50 кД эукариотического белка [3].

В последующих экспериментах бактериальный фермент был получен в чистом виде и охарактеризован. Обнаруженная глюкозилтрансфераза имела молекулярную массу около 60 кД и была названа Lgt1. Фермент был выявлен среди представителей L. pneumophila и не обнаруживался в штаммах других видов легионелл, таких как L. longbeachae, L. gormanii and L. steigerwaltii. Ферментативная активность белка была высокоспецифична. Только УДФ-глюкоза, но не УДФ-галактоза, УДФ-N-ацетил-глюкозамин, УДФ-глюкуроновая кислота или ГДФ-манноза являлись ко-субстратами в реакции модификации [2, 5].

Аминокислотная последовательность Lgt1 не проявляла выраженной гомологии с известными на сегодня и представленными в международных базах данных белками. Наиболее значимая гомология проявлялась между аминокислотными последовательностями центрального участка Lgt1 и энзиматического центра глюкозилирующих токсинов (участок так называемого «DxD мотива» токсинов, продуцируемых Clostridium difficile, C. novyi, C. sordellii и C. perfringens). Последующий поиск в базах данных четырех штаммов L. pneumophila, содержащих информацию полностью отсеквенированных геномах возбудителей, привел к обнаружению 9 открытых рамок считывания, кодирующих белки со значительной гомологией с Lgt1. Основываясь на уровне гомологии, продукты обнаруженных генов были сгруппированы в три семейства, названных Lgt1, Lgt2 и Lgt3. Гены, кодирующие белки Lgt1 и Lgt3 обнаруживались у всех четырех представителей L. pneumophila, тогда как ген lgt2 был найден лишь у единственного штамма с известным геномом – Philadelphia-1.

В последующих исследованиях гены lgt были клонированы и экспрессированы в Escherichia coli, а очищенные вещества были протестированы в реакции глюкозилирования. В этих исследованиях было показано, что 60 кД Lgt1, 70 кД Lgt2 и 100 кД Lgt3 глюкозилировали один и тот же субстрат – эукариотический белок с молекулярной массой около 50 кД [4, 5].

С использованием метода тандемной масс-спектрометрии субстрат глюкозилтрансфераз был идентифицирован. Им оказался эукариотический фактор элонгации 1А (eEF1A), а сайтом присоединения глюкозы был остаток аминокислоты серин в положении 53. Данный белок является одним из необходимых факторов в рибосомном синтезе белка. Он обладает ГТФазной активностью и определяет доставку аминоацилированных молекул тРНК к так называемому А-сайту рибосомы. Кроме этого, eEF1A участвует и в других процессах клетки, таких как трансляционный контроль, укладка синтезированных пептидов, протеосомная деградация дефектных пептидов, регуляция актинового цитоскелета и др. Серин-53, модифицируемый Lgt1, Lgt2 и Lgt3, расположен в NH₂-концевой части G-домена. В связи с этим модификация данного остатка аминокислоты может приводить к нарушениям функционирования всего домена и всего белка [8].

В связи с тем, что основная функция eEF1A связана с его участием в синтезе белка, были проведены специальные эксперименты, направленные на изучение процессов трансляции в присутствии глюкозилтрансфераз легионелл. При этом было установлено, что глюкозилирование фактора элонгации приводит к полной остановке синтеза белка как in vitro в реакции транскрипции/трансляции, так и in vivo при доставке Lgt в эукариотическую клетку мишень. Таким образом, глюкозилтрансферазы Lgt1 L. pneumophila являются биологически-активными молекулами, способными убивать эукариотические клетки-мишени путем блокирования процессов трансляции.

Для того, чтобы участвовать в процессах патогенеза, бактериальный фактор должен быть синтезирован и доставлен к месту своего действия в нужный момент времени. В связи с этим были проведены опыты по изучению динамики синтеза ферментов Lgt при выращивании легионелл на искусственных питательных средах или в амебах Acanthamoeba castellanii. В этих исследованиях было установлено, что Lgt1 и Lgt2 вырабатываются бактериями в поздней стационарной фазе их роста в жидкой питательной среде и на поздней стадии взаимодействия с амебами. В противоположность этим данным Lgt3 определялся в культурах на ранней стадии роста in vitro (лаг-фаза) и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками [5]. В другой серии экспериментов было показано, что все три глюкозилтрансферазы являются эффекторами аппарата секреции 4 типа легионелл и активно доставляются в цитоплазму клеток-мишеней секреторной системой данного типа [6].

Таким образом, полученные данные позволяют предполагать важную роль глюкозилтрансфераз легионелл в патогенности возбудителя. Как показывают экспериментальные данные, подавление белкового синтеза под действием Lgt ведет к гибели пораженных клеток. Следует отметить, что гибель клеток в результате нарушения трансляции занимает несколько дней, в противоположность гибели, индуцированной нарушениями цитоскелета (часы) или разрушением цитоплазматической мембраны (минуты и секунды). В этой связи особый интерес представляет тот факт, что Lgt3 продуцируется бактериями в начальные фазы взаимодействия с фагоцитами, тогда как Lgt1 и Lgt2 – в заключительных фазах. Это позволяет предположить, что в результате действия Lgt3 клетка может переводиться в «беззащитное» «парализованное» состояние и оказывается неспособной препятствовать размножению легионелл. С другой стороны, на финальных этапах взаимодействия легионелл и эукариотических клеток-мишеней возникает необходимость уничтожить «использованную» клетку, и Lgt1/2 могут являться активными эффекторами этого процесса.

Гликозилирование эукариотических белков под действием бактериальных продуктов является важным процессом, определяющим патогенез ряда инфекционных заболеваний. До последнего времени основной поток информации об участии бактериальных гликозилтрансфераз в вирулентности возбудителей был связан с изучением больших токсинов клостридий (C. difficile, C. novyi, C. sordellii и C. perfringens). Однако результаты исследований последнего десятилетия указывали на важную роль гликозилтрансфераз и у других возбудителей инфекционных заболеваний человека. Ярким примером этому является цикл работ по обнаружению и изучению глюкозилтрансфераз Lgt легионелл. Более того, с увеличением объема информации о структуре геномов различных инфекционных возбудителей появляются данные о наличии гликозилирующей активности у новых белков, таких как лимфостатин LifA и токсин В E. coli, цитотоксины Chlamydia и др. Весьма вероятно, что исследования вирулентных свойств возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных в ближайшем будущем приведут к обнаружению новых веществ, выполняющих свою функцию путем гликозилирования тех или иных эукариотических белков.

Список литературы.

1.            Belyi Y., and Aktories K. Bacterial toxin and effector glycosyltransferases. // Biochim Biophys Acta .— 2010. — № 1800. — Р. 134—143.

2.            Belyi Y., Niggeweg R., Opitz B., Vogelsgesang M., Hippenstiel S., Wilm M., and Aktories K. Legionella pneumophila glucosyltransferase inhibits host elongation factor 1A. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. — № 103. — Р. 16953—16958.

3.            Belyi I., Popoff M. R., and Cianciotto N. P. Purification and characterization of a UDP-glucosyltransferase produced by Legionella pneumophila. // Infect Immun. — 2003. — № 71. — Р. 181—186.

4.            Belyi Y., Stahl M., Sovkova I., Kaden P., Luy B., and Aktories K. Region of elongation factor 1A1 involved in substrate recognition by Legionella pneumophila glucosyltransferase Lgt1: identification of Lgt1 as a retaining glucosyltransferase. // JBC. — 2009. — № 284. — Р. 20167—20174.

5.            Belyi Y., Tabakova I., Stahl M., and Aktories K. Lgt: a family of cytotoxic glucosyltransferases produced by Legionella pneumophila. // J Bacteriol. — 2008. — № 190. — Р. 3026—3035.

6.            Hurtado—Guerrero R., Zusman T., Pathak S., Ibrahim A. F., Shepherd S., Prescott A. et al. Molecular mechanism of elongation factor 1A inhibition by a Legionella pneumophila glycosyltransferase. // Biochem J. — 2010. — № 426. — Р. 281—292.

7.            Jank T., and Aktories K. Structure and mode of action of clostridial glucosylating toxins: the ABCD model. // Trends Microbiol. — 2008. — № 16. — Р. 222—229.

8.            Lu, W., Du, J., Stahl, M., Tzivelekidis, T., Belyi, Y., Gerhardt, S. et al. Structural basis of the action of glucosyltransferase Lgt1 from Legionella pneumophila.// J Mol Biol. — 2010. — № 396. — Р. 321—331.

9.            Newton, H. J., Ang, D. K, van Driel, I. R., and Hartland, E. L. Molecular pathogenesis of infections caused by Legionella pneumophila.// Clin Microbiol Rev. — 2010. — № 23. — Р. 274—298.