ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ КЛУБЕНЬКОВ НА КОРНЯХ ЛЮЦЕРНЫ ШТАММАМИ SINORHIZOBIUM MELILOTI РАЗНЫХ nod-ГЕНОТИПОВ

NODULE FORMATION DYNAMICS OF SINORHIZOBIUM MELILOTI STRAINS WITH DIFFERENT nod-GENOTYPES ON ALFALFA ROOTS

Alla Saksaganskaia

post-graduate student, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology,

Russia, Saint Petersburg, Pushkin

Aleksandra Kozlova

student, St. Petersburg State Technological Institute (technical university),

Russia, Saint Petersburg

Victoria Muntyan

junior Researcher, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Russia, Saint Petersburg, Pushkin

Marina Roumiantseva

PhD, Principal Investigator, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology,

Russia, Saint Petersburg, Pushkin

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 15-04-09295а и 17-04-02011а.

АННОТАЦИЯ

Проанализирована динамика образования клубеньков на корнях люцерны Medicago varia и Medicago lupulina штаммами клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti, различавшихся по структурному полиморфизму генов вирулентности (nod генов), в модельных условиях. Показано, что штаммы, имевшие структурные изменения в nodABC и nodH генах (nod-генотип), детерминирующих синтез Nod-фактора, формировали клубеньки раньше, по сравнению с группой штаммов, имевших nod-генотип, сходный с таковым у референтного штамма Rm1021. Выявлены различия между указанными группами штаммов по скорости формирования клубеньков (динамика образования клубеньков) как на растениях одного вида, так и между изученными видами растений-хозяев. Сделано заключение, что разница в динамике образования клубеньков между изученными группами штаммов на поздних стадиях растительно-микробного симбиотического взаимодействия могла быть обусловлена как структурными различиями в синтезируемых бактериями сигнальных молекулах, так и защитными регуляторными процессами со стороны растений-хозяев.

ABSTRACT

The dynamics of the nodule formation on the roots of lucerne Medicago varia and Medicago lupulina by the strains of nodule bacteria Sinorhizobium meliloti, which differed in the structural polymorphism of genes of virulence (nod genes), under model conditions was analyzed. It was shown that strains that had structural changes in nodABC and nodH genes (nod-genotype), which determine Nod-factor synthesis, formed nodules earlier, compared to a group of strains having the nod genotype similar to that of the reference strain Rm1021. Differences between these groups of strains on the rate of nodules formation (the dynamics of nodule formation) were revealed both in plants of one species and between the studied species of host plants. It was concluded that the difference in the dynamics of nodule formation between the studied groups of strains in the late stages of plant-microbial symbiotic interaction could be due to both structural differences in the signal molecules synthesized by bacteria and protective regulatory processes on the part of host plants.

Ключевые слова: S. meliloti; вирулентность; nod гены; образование клубеньков; симбиоз.

Keywords: S. meliloti; virulence; nod genes; nodulation; symbiosis.

Введение. Биологическая азотфиксация – это процесс превращения молекулярного азота атмосферы микроорганизмами (свободно­живущими, ассоциативными и симбиотическими) с образованием биологических форм азота, доступных для живых организмов. Клубеньковые бактерии (ризобии) формируют симбиоз с бобовыми растениями-хозяевами, повышая их продуктивность, которую измеряют массой растений, сформировавшейся в процессе вегетации. Эффективность симбиотической ассоциации «бобовое растение – клубеньковые бактерии» определяется успешностью взаимодействия их генетических систем, в том числе наличием у ризобий целого комп­лекса генов, детерминирующих такие признаки как: вирулентность, азотфиксирующая активность, эффективность, конкурентоспособность и специфичность по отношению к растениям-хозяевам.

Процесс формирования бобово-ризобиального симбиоза обусловлен молекулярным сигналингом между обоими симбиотическими партнерами. В условиях недостатка азота в почве, бобовые растения секретируют флавоноиды в ризосферу. В ответ на синтезируемые корнями растений флавоноиды, происходит активация экспрессии nod генов клубеньковых бактерий (ризобии), локализованных на симбиотической мегаплазмиде SMa. Эти гены ризобий детерминируют процесс синтеза сигнальных молекул, Nod-факторов, представляющих собой липохитоолигосахариды. Среди структурных nod генов особо выделяют гены nodA, nodB и nodC, которые присутствуют у всех видов ризобий, формирующих симбиоз. У клубеньковых бактерий люцерны за синтез видоспецифичной молекулы Nod-фактора, помимо трех указанных выше генов, отвечает также ген nodH, кодирующий фермент сульфотрансферазу. Показано, что мутанты S. meliloti по гену nodH, которые синтезировали несульфатированный Nod-фактор, теряли способность инокулировать люцерну, но приобретали способность формировать клубеньки на вике, не являющейся растением-хозяином [3, с. 1136]. Таким образом, структура Nod-факторов является важнейшей детерминантой хозяйской специфичности симбиоза. Nod-факторы взаимодействуют с рецепторами бобовых растений, запуская каскад реакций: деформацию и скручивание корневых волосков, а также индукцию клеточных делений в коре корня, приводящих, в конечном итоге, к образованию нового органа на корнях растений – клубенька. Единичные мутации в рецепторах Nod-факторов растений существенно изменяют специфичность взаимодействия на уровне вида [5] и выявлен ряд детерминант, контролирующих процесс клубенькообразования со стороны растения-хозяина.

Представляло интерес изучить динамику образования клубеньков штаммами клубеньковых бактерий люцерны с измененной структурой nod генов в типовых условиях.

Материалы и методы исследований. Для постановки микровегетационного опыта в качестве растений-хозяев были взяты Medicago varia (сорт «Вега 87») и Medicago lupulina (сорт «Мира»). Семена растений стерилизовали серной кислотой и проращивали двое суток при температуре +4°С до появления корней. Затем помещали по 2 проростка в пробирки с агаризованной безазотистой средой Красильникова-Кореняко и оставляли прорастать при комнатной температуре. Через два дня проростки инокулировали штаммами ризобий. Штаммы предварительно выращивали на твердой питатель­ной среде TY при температуре 28°С, затем смешивали с 1-кратным раствором микроэлементов. Растения выращивали в 10-ти повторностях при температуре 20-22°С при режиме освещенности - 16000 лк; 16/8 ч (день/ночь) в течение 38 дней [6]. Динамику образования клу­беньков оценивали по времени их появления и количеству на корнях растений. Подсчет клубеньков производился во всех повторностях ежедневно с 1 по 16 день после инокуляции, и через день с 16 по 38 день после инокуляции. Статистическую обработку данных выполняли в пакете программ “MS Excel 2007”.

Результаты исследований. Для сравнительного анализа динамики образования клубеньков было отобрано 2 группы природных штаммов S. meliloti, контрастно различавшихся по структуре генов вирулентности, из коллекции лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ФГБНУ ВНИИСХМ. Первая группа представлена 3 штаммами с nod‑генотипом (A) (типовым, сходным с таковым у референтного штамма Rm1021 [2, с. 671]; частота встречаемости данного генотипа в природной популяции 0.30) и 3 штамма с nod-генотипом (M), характеризовавшимся структурными изменениями всех четырех изученных генов вирулентности (nodABC, nodH). Данный nod-генотип встречался в выборке природных штаммов S. meliloti также с достаточно высокой частотой (0.23) и особенно широко распространен на Северном Кавказе – первичном центре разнообразия люцерн.

а)  

б)

Рисунок 1. Суммарное количество клубеньков, образованных на корнях растений M. varia (а) и M. lupulina (б), в динамике

Штаммы с типовым nod-генотипом (A) начинали формировать клубеньки на растениях M. varia и M. lupulina на 10 и 13 дни после инокуляции, соответственно (рис. 1). Группа штаммов с nod-генотипом (M) начинала формировать клубеньки на растениях M. varia и M. lupulina на 8-ой день после инокуляции. Т. е. штаммы с измененной структурой nod генов раньше вступали в симбиоз с изучаемыми видами растений-хозяев, по сравнению со штаммами с типовой структурой nod генов.

Суммарное количество клубеньков, образованных штаммами с nod-генотипом (M) на растениях M. varia было ниже по сравнению со штаммами с nod-генотипом (A) до 25-го дня после инокуляции. После 25-го дня количество клубеньков резко увеличилось и к концу микровегетационного опыта (38 день) составило 52±13, то есть в два раза больше по сравнению со штаммами с типовым генотипом (27 ± 1; рис. 1, а). На растениях другого растения-хозяина – M. lupulina было установлено, что с 20-го дня среднее количество клубеньков, сформированных штаммами с типовым nod-генотипом, было выше, по сравнению с группой штаммов с nod-генотипом (M) (рис. 1, б). Однако тенденция увеличения количества клубеньков была сходной.

Таблица 1.

Среднее количество клубеньков, образовавшихся в разные периоды микровегетационного опыта

Динамика формирования клубеньков на корнях M. varia в симбиозе со штаммами с типовым nod-генотипом была равномерной в течение всего периода микровегетационного опыта (в среднем от 7 до 10 клубеньков каждые 10 дней вегетации; табл. 1). Штаммы с nod-генотипом (M) в период с 10-го по 20 день формировали сходное число клубеньков, как и штаммы с nod-генотипом (А). Однако в последующие периоды (с 20 по 30, с 30 по 38 дни) среднее количество образовавшихся клубеньков в 2,5-3 раза превышало таковое в первый период. Динамика формирования клубеньков на корнях M. lupulina в период с 10 по 20 день была сходной по общему числу сформированных клубеньков для штаммов обеих групп (табл. 1). Таким образом, показано, что динамика образования клубеньков штаммами, имевшими различные nod-генотипы, на растениях-хозяевах одного вида была различной. Также отличия в динамике формирования клубеньков выявлены между двумя разными видами растений-хозяев.

Выводы. Проведен сравнительный анализ динамики образования клубеньков двумя группами штаммов, контрастно различавшихся по структуре генов вирулентности (nod генов). Показана взаимосвязь структуры генов вирулентности и динамики образования клубеньков. Штаммы с nod-генотипом, характеризовавшихся структурными измене­ниями всех изученных генов вирулентности, раньше вступали в симбиоз с обоими видами растений-хозяев, по сравнению со штаммами, имев­шими nod-генотип, сходный с таковым у референтного штамма Rm1021. Структурные изменения генов вирулентности могут обуславливать структурные изменения сигнальной молекулы Nod-фактора, согласно. По-видимому, выявленные нами различия между группами штаммов, имевшими разную структурную организацию генов вирулентности, в динамике образования клубеньков на поздних стадиях растительно-микробного симбиотического взаимодействия, могли быть обусловлены как структурными модификациями синтезируемых бактериями сиг­нальных молекулах, согласно [1, с. 364], так и защитными регуляторными процессами со стороны растений-хозяев, согласно [4].

Фундаментальные знания о механизмах формирования эффектив­ного бобово-ризобиального симбиоза, особенно его ранних этапов, имеют важное значение для выявления штаммов клубеньковых бактерий, потенциально пригодных для создания биопрепаратов, обуславливающих успешное развитие земледелия на основах экологической безопасности.

Список литературы:

1. Debelle F., Moulin L., Mangin B. et al. Nod genes and Nod signals and the evolution of the Rhizobium legume symbiosis // Acta Biochim. Pol. 2001. Vol. 48. № 2. P. 359 — 365.
2. Galibert F., Finan T.M., Long S.R. et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti // Science. 2001. Vol. 293. Iss. 5530. P. 668-672.
3. Roche P., Debelle F., Maillet F. et al. Molecular basis of symbiotic host specificity in Rhizobium meliloti: nodH and nodPQ genes encode the sulfation of lipo-oligosaccharide signals // Cell. 1991. Vol. 67. Iss. 6. P. 1131-1143.
4. Toth K., Stacey G. Does plant immunity play a critical role during initiation of the legume-rhizobium symbiosis? // Front. Plant Sci. 2015. Vol. 6:401. doi: 10.3389/fpls.2015.00401.
5. Via V.D., Zanetti M.E., Blanco F. How legumes recognize rhizobia // Plant Signal Behav. 2016. Vol. 11. Iss. 2. e1120396.
6. Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценоза. Теоретические основы и методы / [под ред. Румянцевой М.Л., Симарова Б.В.] СПб-Пушкин, ВНИИСХМ, Научное издание. Инновационный центр защиты растений, 2011. 104 с.