ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ ПЛАЗМЫ И МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ У КРОЛИКОВ И КРЫС, ВЫЗВАННЫМ ИММУНИЗАЦИЕЙ ЛПВП ЧЕЛОВЕКА

LIPID COMPOSITION OF PLASMA AND BLOOD MONONUCLEAR CELLS IN EXPERIMENTAL ATHEROSCLEROSIS IN RABBITS AND RATS CAUSED BY IMMUNIZATION WITH HUMAN HDL

Abdulkadhim Zerjawi

 graduate student of the Department of Immunology and Cell Biology, Udmurt State University,

Russia, Izhevsk

Ksenia Fomina

Candidate of Science, Senior Researcher of Laboratory of Molecular and Cell Immunology, Udmurt State University, Senior Researcher, Udmurt Federal Research Center UB RAS,

Russia, Izhevsk

Lyubov Beduleva

Doctor of Sciences, Professor of the Department of Immunology and Cell Biology, Assistant professor, Udmurt State University, Leading Researcher, Udmurt Federal Research Center UB RAS,

Russia, Izhevsk

Igor Menshikov

Doctor of Sciences, Professor of the Department of Immunology and Cell Biology, Professor, Udmurt State University, Chief Researcher, Udmurt Federal Research Center UB RAS,

Russia, Izhevsk

АННОТАЦИЯ

Этиология атеросклероза остаётся сегодня до конца неясной, несмотря на многочисленные исследования. Одной из гипотез о причинах развития атеросклероза является аутоиммунная гипотеза, рассматривающая аутоиммунные реакции как причину развития атеросклероза. Ранее нами было показано, что иммунизация нативными липопротеинами высокой плотности человека (нчЛПВП) с неполным адьювантом Фрейнда (НАФ), приводит к атеросклерозоподобным изменениям в стенке аорты кроликов и крыс. Вызывает ли такая иммунизация изменения в липидном обмене? Получить ответ на данный вопрос было целью исследования. Исследовали липидный состав плазмы и мононуклеаров периферической крови методом тонкослойной хроматографии липидов у кроликов и крыс, иммунизированных липопротеинами высокой плотности человека. Иммунизация крыс и кроликов как нчЛПВП/НАФ, так и НАФ вызвала сходные изменения   в липидном составе плазмы и мононуклеаров крови относительно интактных животных. Заключили, что изменения в липидном обмене иммунизированных кроликов и крыс являются неспецифическими и не ассоциированы с атеросклерозоподобными изменениям в стенке аорты, которые наблюдались только у животных иммунизированных нчЛПВП/НАФ. Выявленные различия в липидном составе между иммунизированными кроликами и крысами отражают видовую специфику в липидном обмене.

ABSTRACT

The etiology of atherosclerosis remains unknown despite numerous studies. One of the hypotheses about the cause of atherosclerosis is the autoimmune hypothesis, which considers autoimmune reactions as the cause of atherosclerosis. We have previously shown that immunization with native human high-density lipoproteins (nhHDL) with incomplete Freund's adjuvant (IFA) leads to atherosclerosis-like changes in the aortic wall of rabbits and rats. Does this immunization cause changes in lipid metabolism? To get an answer to this question was the goal of this study. The lipid composition of plasma and blood mononuclear cells was studied by thin layer chromatography of lipids in rabbits and rats immunized with human high density lipoproteins. Immunization of rats and rabbits with both nhHDL+IFA and IFA caused similar changes in the lipid composition of plasma and blood mononuclear cells relative to intact animals. It was concluded that changes in lipid metabolism in immunized rabbits and rats are nonspecific and not associated with atherosclerosis-like changes in the aortic wall, which were observed only in animals immunized with nhHDL+IFA. Differences in lipid composition between immunized rabbits and rats reflect species specificity in lipid metabolism.

Ключевые слова: липидный обмен; экспериментальный атеросклероз; аутоиммунные реакции.

Keywords: lipid metabolism; experimental atherosclerosis; autoimmune reactions.

Введение

Несмотря на многочисленные исследования, этиология атеросклероза остается неизвестной. Большинство существующих теорий и гипотез опирается на принципиальную связь между атеросклерозом и дислипидемией (проявляющейся в гиперхолестеринемии), которая   рассматривается как причина развития заболевания. Поэтому большинство известных сегодня экспериментальных моделей на животных разрабатывались на основе этой причинно-следственной связи [8, с. 1173]. Однако, за все время не получено убедительных доказательств тому, что дислипидемия является причиной атерогенеза. Привлекательной является аутоиммунная гипотеза [9, с.116], которая ближе всего стоит к воспалительным теориям атерогенеза. Ранее нами были представлены две экспериментальные модели атеросклероза крыс и кроликов, индуцированного иммунизацией липопротеинами человека [7; 4, с. 566]. В этих моделях индуцировалась аутоиммунная реакция на собственные липопротеины традиционным для экспериментальных моделей аутоиммунных заболеваний способом – иммунизацией гетерологичным антигеном.  Было показано, что однократная иммунизация крыс и кроликов липопротеинами человека приводила к атеросклерозоподобным изменениям в стенке аорты. В связи, с чем представляется интересным выяснить, вызывает ли индуцированная иммунизацией аутоиммунная реакция у экспериментального животного изменения в липидном обмене.  С этой целью исследовали липидный состав плазмы и мононуклеаров крови у кроликов и крыс, иммунизированных липопротеинами высокой плотности человека.

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Белые кролики-гиганты в возрасте 2 месяцев были получены из Удмуртского ветеринарно-диагностического центра (Ижевск, Россия). Самцы крыс Wistar были получены от питомника Рапполово (Рапполово, Россия). До и во время эксперимента животные содержались на стандартном корме без добавок и имели неограниченный доступ к воде.

Иммунизация и забор крови

Кроликов в возрасте 2 месяцев (n = 4) и крыс (n = 8) иммунизировали нативным человеческим ЛПВП (нчЛПВП) (Kalen Biomedical, США). Липопротеины вводили однократно внутрикожно в дозе 200 мкг (по белку) на кролика / крысу в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) (InvivoGen, США). Контрольным кроликам (n = 3) и контрольным крысам (n = 6) внутрикожно вводили НАФ. Также в исследовании участвовали интактные самцы кроликов (n = 6) и крыс (n = 12), которые не получали инъекции липопротеинов и НАФ.

Кровь собирали у крыс и кроликов из хвостовой или ушной вены соответственно в течение 6 недель после иммунизации. Определяли липидный состав плазмы и мононуклеров крови, выделенных на градиенте фиколл-верографин. 

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови

Периферическую кровь, полученную с цитратом натрия, разделяли на градиенте фиколл-верографин (ρ=1,08 г/см3). Далее суспензию мононуклеарных клеток отмывали ЗФР.

Липидный состав плазмы и монокулеарных клеток крови кроликов и крыс

Липиды экстрагировали из плазмы и мононуклеарных клеток крови методом Фолча, разделяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля Sorbfil (ООО «ИМИД», Россия) в смеси гексан: диэтиловый эфир: метанол: ледяная уксусная кислота в соотношении 9:2:0,2:0,3. Затем липидные фракции экстрагировали из силикагеля. Количество липидов в каждой фракции определяли по углероду путем сжигания с серной кислотой при 200°C с последующей фотометрией при 405нм. Рассчитывали процентное соотношение липидных фракций.

Статистический анализ данных

Достоверность различий оценивали по критерию Манна-Уитни.

Результаты исследования

Известно, что НАФ, использующийся для повышения иммуногенности антигена при иммунизации, сам по себе не является иммунологически инертным. Как правило НАФ используется для повышения иммуногенности антигена, в том числе и в экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит и аутоиммунный энцефаломиелит у крыс [5, с. 1262]. В то же время, в ряде исследований было показано, что НАФ может индуцировать специфическую толерантность к аутоантигенам [6, с. 5776], в том числе и на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [10, с. 24], что подчеркивает необходимость учета такого влияния при использовании НАФ в исследованиях на экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний. Поэтому мы сравнили результаты, полученные в трех группах животных: интактных; иммунизированных НАФ; иммунизированных нчЛПВП в составе НАФ.

Липидный состав плазмы и мононуклеаров крови кроликов и крыс, иммунизированных нчЛПВП/НАФ, получивших НАФ и интактных животных представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Соотношение липидных фракций в плазме и мононуклеарах крови кроликов (A) и крыс (Б), иммунизированных нативными липопротеинами высокой плотности человека в неполном адьюванте Фрейнда (нчЛПВП/НАФ), неполным адьювантом Фрейнда (НАФ) и интактных животных (Интактные)

Примечание: Для крыс и кроликов, которых иммунизировали нчЛПВП/НАФ и вводили НАФ, приводится среднее значение образцов, полученных через 5 и 6 недель после иммунизации. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n - количество образцов. ФЛ - фосфолипиды, ДГ- диглицериды, ХС- свободный холестерин, СЖК - свободные жирные кислоты, ТГ- триглицериды, ЭХС- эфиры холестерина, ОХС- общий холестерин. * p ≤0,05; ** p ≤0,1 - достоверность различий относительно интактной группы животных, критерий Манна-Уитни.

У кроликов, иммунизированных как нчЛПВП/НАФ, так и НАФ уровень диглицеридов (ДГ) и холестерина (ХС) в плазме крови был ниже, а уровень эфиров холестерина (ЭХС) выше, чем у интактных. Кролики, иммунизированные нчЛПВП/НАФ отличаются от интактных и иммунизированных только НАФ повышенным уровнем в плазме крови фосфолипидов (ФЛ) и общего холестерина (ОХС), однако данное различие статистически не значимо. В мононуклеарах различие было достоверным только в группе, получившей инъекцию НАФ, ДГ были ниже, а свободные жирные кислоты (СЖК) были выше относительно интактных кроликов (Таблица 1 А).

У крыс, иммунизированных нчЛПВП/НАФ и НАФ, был достоверно выше уровень СЖК и ниже уровень общего холестерина в плазме крови относительно интактных крыс. В мононуклеарах был достоверно ниже уровень ДГ и выше СЖК (Таблица 1 Б).

Обращает на себя внимание тот факт, что изменения в липидном составе плазмы и мононуклеаров крови были сходными у животных иммунизированных нЛПВП/НАФ и получивших только инъекцию НАФ, относительно интактных животных. При этом, достоверных различий в липидном составе плазмы и мононуклеаров крови между группами животных иммунизированных нЛПВП/НАФ и получивших только НАФ не найдено. 

Обсуждение результатов

Ранее нами были обнаружены атеросклерозоподобные изменения в дуге аорты крыс, иммуниизированных нчЛПВП/НАФ, в частности, увеличение толщины комплекса интима-медиа, нарушение структуры медиа, лейкоцитарная инфильтрация. У интактных крыс и крыс, получивших инъекцию НАФ, изменений в дуге аорты не выявлено [3, с. 129]. Морфологические особенности строения интимы сосудов крыс, которая в отличие от человека представлена однослойным эндотелием, могут не позволить увидеть развития стадий атеросклеротических повреждений аорты более типичных для человека. У кроликов морфология аорты ближе к человеку, поэтому аналогичные эксперименты были проведены нами на кроликах. Эксперименты показали, что иммунизация кроликов нчЛПВП/НАФ вызывает типичные для атеросклероза человека изменения в стенке аорты [4, с. 566]. В настоящем исследовании также был проведен гистологический анализ, подтвердивший ранее полученные результаты. Только у кроликов и крыс, иммунизированных нчЛПВП/НАФ, обнаружены атеросклерозоподобные изменения в стенке аорты.

Изменения в липидном составе плазмы и мононуклеаров крови у животных, иммунизированных нчЛПВП/НАФ и НАФ, были сходны относительно интактных, особенно у крыс. Следовательно, изменения в липидном составе плазмы крови кроликов и крыс, иммунизированных нчЛПВП/НАФ и животных, получивших НАФ, вызваны НАФ и не связаны с атеросклеротическими изменениями аорты, которые были обнаружены только у кроликов и крыс, иммунизированных нчЛПВП/НАФ.

В ответ на иммунизацию как нчЛПВП/НАФ, так и НАФ, изменения в липидном составе плазмы крови у кроликов и крыс были разными. Причиной этому могут быть видовые различия в обмене липопротеинов между ними. Известно, что одной из основных функций липопротеинов является транспорт полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) [1, с. 29].  У части видов животных (приматы, кролики) и человека клетки поглощают ПНЖК в форме эфиров холестерина, находящихся в составе липопротеинов низкой плотности, путем апоВ-100-эндоцитоза. У иных видов (крысы и мыши) клетки поглощают ПНЖК также в форме эфиров холестерина, но в составе ЛПВП через апоЕ/А-I-рецепторы. Белок переносящий эфиры холестерина (БПЭХ) у животных регулирует поглощение клетками ПНЖК через апоВ-100 или апоЕ/А-I-рецепторы, осуществляя обмен неполярных поли -ЭХС и полярных ДГ между ЛПВП и ЛПНП. ДГ, образующиеся при гидролизе триглицеридов (ТГ), переносятся БПЭХ в ЛПВП, этерифицируются в них, и в форме ЭХ переносятся БПЭХ ЛПНП.  Поэтому у млекопитающих, которые синтезируют БПЭХ, клетки поглощают ПНЖК в виде поли-ЭХС в составе ЛПНП путем апоВ100-эндоцитоза. У млекопитающих, которые утратили способность синтеза БПЭХ, клетки поглощают ПНЖК также в поли-ЭХС, но, в составе ЛПВП через апоЕ/А-I-рецепторы. Синтезируя БПЭХ, животные являются чувствительными к экзогенной гиперхолестеринемии, это относится к приматам, человеку и кроликам. Те же виды животных, которые БПЭХ не синтезируют, считаются резистентными к развитию экзогенной гиперхолестеринемии и атеросклерозу [2, с. 162].

В наших экспериментах у кроликов, иммунизированных как нчЛПВП/НАФ, так и НАФ снизилась доля ДГ в плазме крови и увеличилась доля ЭХС относительно интактных кроликов, что может быть следствием изменения в обмене ДГ и ЭХС между липопротеинами, осуществляемым БПЭХ. Уровень диглицеридов положительно коррелирует с уровнем свободного холестерина (рисунок 1A), который снижается у иммунизированных нчЛПВП/НАФ и НАФ кроликов, при одновременном росте эфиров холестерина. Кроме того, уровень диглицеридов отрицательно коррелирует с уровнем СЖК в плазме крови иммунизированных кроликов (рисунок 1Б).

Рисунок 1. Корреляционный анализ уровней свободного холестерина (ХС) и диглицеридов (ДГ) (A) и уровней свободных жирных кислот (СЖК) и диглицеридов (ДГ) (Б) в плазме крови кроликов, иммунизированных нчЛПВП/НАФ, кроликов, получивших НАФ и интактных

Указанные факты позволяют предположить, что нарушение в обмене липопротеинов, вызванное иммунизацией нчЛПВП/НАФ и НАФ у кроликов приводит к уменьшению доставки ПНЖК клеткам в составе ЛПВП в форме эфиров холестерина, образующихся в них из доставленных БПЭХ диглицеридов от ЛПНП, через apoE/A-1 эндоцитоз. Мы предполагаем, что при этом компенсаторно увеличивается доставка ПНЖК в клетки в форме эфиров холестерина в составе ЛПНП через apoB-100 эндоцитоз, и увеличивается липолиз ТГ в ЛПНП до СЖК, акцептором и переносчиком которых является альбумин.  На это же указывают изменения в липидном составе мононуклеаров кроликов, иммунизированных НАФ, у которых достоверно увеличивается доля СЖК и снижается уровень ДГ.

У крыс нет БПЭХ, поэтому нет взаимообмена ДГ и ЭХС между ЛПВП и ЛПНП как у кроликов и доставка ПНЖК клеткам осуществляется преимущественно в форме ЭХС в составе ЛПВП путем апоЕ/А-I-эндоцитоза. Поэтому уровень ЛПВП у крыс выше чем ЛПНП. Изменения в обмене липидов плазмы крови у иммунизированных нчЛПВП/НАФ и крыс, получивших НАФ, по сравнению с интактными, проявились в значительно росте СЖК в крови. По-видимому, иммунизация крыс как нчЛПВП/НАФ, так и НАФ, приводит к нарушению основного для крыс пути доставки ПНЖК клеткам в форме ЭХС составе ЛПВП через апоЕ/А-I-рецепторы, что адаптивно усиливает доставку ПНЖК в форме СЖК- альбумин. На это же указывает корреляционная связь между СЖК и ОХС в плазме крови (рис. 2), и изменение липидного состава мононуклеаров. Со снижением уровня ОХС в крови иммунизированных крыс увеличивается СЖК, а увеличение доли СЖК в клетках сопряжено со снижением диглицеридов (табл.1). 

Рисунок 2. Корреляционный анализ уровней общего холестерина (ОХС) и свободных жирных кислот (СЖК) плазме крови крыс, иммунизированных нчЛПВП/НАФ, крыс, получивших НАФ и интактных

Сделанные выше предположения — это попытка непротиворечивого объяснения полученных фактов и, безусловно, предполагает дальнейшие исследования. 

Выводы

Таким образом, результаты исследования показали, что изменения в липидном составе плазмы и мононуклеаров крови были сходными у животных иммунизированных как нчЛПВП/НАФ, так и НАФ.  Следовательно, атеросклерозоподобные изменения в стенке аорты, наблюдаемые только у животных иммунизированных нчЛПВП/НАФ, не ассоциированы с изменениями в липидном обмене. Различие в изменении липидного состава плазмы крови у иммунизированных животных между кроликами и крысами может быть обусловлено видовыми различиями в липидном обмене.

Финансирование: Работа поддержана Министерством науки и высшего образования РФ (проект номер 0827-2020-0012, государственное задание номер 075-00232-20-01).

Список литературы:

1. Титов В.Н. Белок, переносящий эфиры холестерина, физико-химические свойства, функция, роль в патогенезе атеросклероза и основания для ингибирования (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. – 2014. – №.8.  Р. 29–36.
2. Barter P.J., Brewer H.B. Jr, Chapman M.J., Hennekens C.H., Rader D.J., Tall A.R. Cholesteryl ester transfer protein: A novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerosis // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2003. – Vol.23, №2. – Р. 160–167.
3. Fomina K., Beduleva L., Menshikov I., Anikaeva M., Suntsova D., Sidorov A., Stolyarova E. Immune Response to Native Lipoproteins Induces Visceral Obesity and Aortic Wall Injury in Rats: The Role of Testosterone // Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets. – 2017. – Vol.17, №2. – Р.125–133.
4. Fomina K., Beduleva L., Menshikov I., Zerjawi A., Terentiev A., Sidorov A., Khramova T., Abisheva N., Gorbushina A.  Аtherosclerosis-like changes in the rabbit aortic wall induced by immunization with native high-density lipoproteins // Immun Inflamm Dis. – 2020. – Vol. 8, №4. – Р. 559–567.
5. Haanstra K.G., Jagessar S.A., Bauchet A.-L., Doussau M., Fovet C.-M., Heijmans N. et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis with recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein in incomplete Freund’s adjuvant in three non-human primate species // Journal of Neuroimmune Pharmacology.  – 2013. – Vol.8, №5. – P. 1251–1264.
6. Heeger P.S., Forsthuber T., Shive C., Biekert E., Genain C., Hofstetter H.H. et al. Revisiting tolerance induced by autoantigen in incomplete Freund’s adjuvant // The Journal of Immunology. – 2000. – Vol.164, №11. – P. 5771–5781. doi:10.4049/jimmunol.164.11.5771
7. Menshikov I., Fomina K., Beduleva L. Atherosclerosis in rats after immunization with human native low-density lipoproteins // Front. Immunol. Conference Abstract: 15th International Congress of Immunology (ICI). (Milan, Italy, 22–27 Aug. 2013 г.). – doi: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.00389
8. Moghadasian M.H., Frohlich J.J., McManus B.M. Advances in Experimental Dyslipidemia and Atherosclerosis // Laboratory Investigation. – 2001. – Vol.81, №9. – 1173–1183.
9. Sima P., Vannucci L., Vetvicka V. Atherosclerosis as autoimmune disease // Annals of Translational Medicine. – 2018. – Vol. 6, №7. – P.116.  
10. Zamora A., Matejuk A., Silverman M., Vandenbark A.A., Offner H. Inhibitory Effects of Incomplete Freund’s Adjuvant on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis // Autoimmunity. – 2002. – Vol. 35, №1. Р. 21–28.