ГИСТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ СУБХРОНИЧЕСКОГО СОЧЕТАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ АЦЕТАТА СВИНЦА И ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ)

HISTOMORPHOLOGICAL CHANGES IN THE LIVER AFTER SUBCHRONIC COMBINED EXPOSURE TO LEAD ACETATE AND PHYSICAL LOAD (EXPERIMENTAL DATA)

Ilzira Minigalieva

Doctor of Biological Sciences, Head of the Department of Toxicology and Bioprophylaxis, Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

Russia, Yekaterinburg

Lada Shabardina

Research assistant of the Department of Toxicology and Bioprophylaxis, Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

 Russia, Yekaterinburg

Marina Sutunkova

Doctor of Medical Sciences, Director at Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

Russia, Ekaterinburg

Alexandra Kungurtseva

Research assistant of the Department of Toxicology and Bioprophylaxis, Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

 Russia, Yekaterinburg

Yulia Ryabova

Ph.D., Head of the Laboratory of Scientific Bases for Biological Prophylaxis, Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

Russia, Yekaterinburg

Karen Nikoghosyan

Research assistant of the Department of Toxicology and Bioprophylaxis, Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

 Russia, Yekaterinburg

Ekaterina Petrunina

Research assistant of the Department of Toxicology and Bioprophylaxis, Yekaterinburg Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection in Industrial Workers,

Russia, Yekaterinburg

АННОТАЦИЯ

Введение. Причиной возникновения профессиональных гепатопатий может стать влияние различных факторов производственной среды на организм. Опасность представляют соли тяжелых металлов, особенно свинца, негативное влияние которого затрагивает практически все органы и системы человека. Цель исследования – изучение состояния печени крыс после воздействия ацетата свинца и физической нагрузки в условиях субхронического эксперимента по гистоморфологическим показателям. Материалы и методы. Животные были поделены на четыре группы случайным образом, по 12 животных в каждой. Первая группа животных подвергалась воздействию ацетата свинца («Pb»), вторая являлась контрольной («Контроль»), крысы третьей группы получали физическую нагрузку («ФН»), четвертая группа подвергалась воздействию ацетата свинца на фоне физической нагрузки («Pb+ФН»). В течение 6 недель 3 раза в неделю внутрибрюшинно животным экспериментальной группы вводили по 2 мл раствора 3-водного ацетата свинца в дозировке 11 мг/кг массы тела, соответствующей 1/20 от LD₅₀. Контрольные животные получали стерильный физический раствор в объеме 2 мл. Для моделирования физической нагрузки часть животных получали нагрузку на тредмиле (5 раз в неделю, 10 минут в день, скорость составила 25 м/мин). Результаты. Патоморфологические изменения в печени крыс при введении ацетата свинца проявлялись дистрофическими изменениями, а морфометрические подсчеты показали, что негативные эффекты усиливаются на фоне физической нагрузки. Выводы. Субхронический эксперимент с введением ацетата свинца в разовой дозе 11 мг/кг массы тела оказывает отрицательные эффекты на состояние ткани печени, которые усиливаются на фоне физической нагрузки.

ABSTRACT

Introduction. The cause of occupational hepatopathy can be the influence of various factors in the working environment on the body. The danger comes from salts of heavy metals, especially lead, which negatively affects almost all human organs.and systems. The purpose – to study the condition of the liver of rats after exposure to lead acetate and physical activity in a subchronic experiment using histomorphological indicators Material and methods. The animals were randomly divided into four groups, each containing 12 animals. The first group of animals was exposed to lead acetate (Pb), the second was a control (Control), the rats of the third group received physical activity (PA), the fourth group was exposed to lead acetate against the background of physical activity (Pb+PA). For 6 weeks, 3 times a week, animals in the experimental group were injected intraperitoneally with 2 ml of a solution of 3-aqueous lead acetate at a dosage of 11 mg/kg body weight, corresponding to 1/20 of the generally accepted average lethal dose. Control animals received sterile physical solution in a volume of 2 ml. To simulate physical activity, some of the animals received exercise on a treadmill (5 times a week, 10 minutes a day, speed was 25 m/min).

Results. Pathomorphological changes in the liver of rats with the introduction of lead acetate were manifested by dystrophic changes, and morphometric calculations showed that the negative effects intensified against the background of physical activity. Conclusion. A subchronic experiment with the administration of lead acetate in a single dose of 11 mg/kg body weight has negative effects on the condition of liver tissue, which are enhanced by physical activity.

Ключевые слова: гепатотоксичность; гистология; ацетат свинца; экспериментальные исследования.

Keywords: hepatotoxicity; histology; lead acetate; experimental studies.

ВВЕДЕНИE

Вредное действие ряда производственных факторов (неорганические вещества) в сочетании с факторами трудового процесса (тяжелая физическая нагрузка), вызывающие нарушение функций внутренних органов, характерными признаками являются, как правило, функциональные поражения печени. Часто токсические гепатопатии протекают бессимптомно в течение продолжительного времени. Признаки поражения печени обычно проявляются у рабочих с большим стажем и характеризуются диспепсическим и болевым синдромами. Среди неорганических токсикантов можно выделить большую группу так называемых гепатотропных ядов, одним из которых является свинец. Экспозиция организма рабочих на производстве к свинцу, как правило, сочетается с мышечной работой большей или меньшей тяжести, однако влияние этого сочетания на развитие патологических процессов в печени изучено недостаточно. Для изучения сочетанного действия факторов производственной среды, которым подвергаются большое число рабочих, занятых в металлургическом производстве, мы выбрали исследование гистоморфологических изменений в печени у крыс при свинцовой интоксикации и физической нагрузки.

При хронической интоксикации свинцом чаще всего наблюдаются легкие формы поражения печени с функциональными ее изменениями. Тем не менее ряд авторов наблюдали тяжелые печеночные поражения с исходом в цирроз при хронической интоксикации свинцом. Е. М. Тареев, говоря об особенностях течения токсических гепатитов и отмечая в целом благоприятный прогноз без тенденции к прогрессированию, приводит как исключение пример развития цирроза печени (доказанного морфологически) у больного с хронической свинцовой интоксикацией. Материалы клинических наблюдений последних лет свидетельствуют о том, что при легком сатурнизме поражения печени носят нестойкий характер и выражаются в умеренных нарушениях ее функциональной способности без выраженных признаков гепатита. Прекращение контакта со свинцом и оздоровительные мероприятия приводят к восстановлению функций печени [1].

Вместе с тем, в научной литературе имеются данные экспериментальных работ, показывающие изменения функций печени при воздействии свинца на лабораторных животных. Например, при пероральном введении крысам ацетата свинца в течение 30 дней в дозе 70,5 мг/кг м.т., было показано развитие белковой дистрофии, гибель гепатоцитов и увеличение количества полиядерных печеночных клеток [2]. В другом исследовании, когда мыши получали перорально ацетат свинца в дозе 1 мг/100 г м.т. и масляный раствор альфа-токоферола в дозе 0,2 мг/100 г м.т. в течение 30 суток, обнаружено, что средняя площадь профильного поля ядер снижена до 21,26 ± 0,65 мкм², что составило 34% от контроля [3]. В эксперименте, где свинцовая интоксикация моделировалась в течение трех месяцев на белых мышах, получавших перорально ацетат свинца в дозе 1 мг/100 г м.т., также выявлены изменения в печени.  Показаны дистрофически-измененные эндотелиоциты синусоидов и центральных вен печени, отмечалась обтурация просветов капилляров клетками Купфера [4]. Вместе с этим влияние сочетанного действия свинца и физической нагрузки на состояние печени, оцененное по патоморфологическим показателям в известной нам литературе, не было найдено.

Цель исследования – изучение состояние ткани печени крыс после воздействия ацетата свинца и физической нагрузки в условиях субхронического эксперимента по гистоморфометрическим показателям.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент был смоделирован на половозрелых аутбредных крысах-самцах собственного разведения со средней массой тела 253,23±1,76 г на начало исследования (разброс между животными не превышал ± 10 %) и возрастом 12-15 недель. Животные были поделены на четыре группы случайным образом, по 12 животных в каждой. Первая группа животных подвергалась воздействию ацетата свинца (Pb), вторая являлась контрольной («Контроль»), крысы третьей группы получали физическую нагрузку («ФН»), четвертая группа подвергалась воздействию ацетата свинца на фоне физической нагрузки («Pb+ФН»). В течение 6 недель 3 раза в неделю внутрибрюшинно животным экспериментальных групп («Pb» и «Pb+ФН») вводили по 2 мл раствора 3-водного ацетата свинца в дозировке 11 мг/кг м.т., соответствующей 1/20 от общепринятой LD₅₀. Контрольные животные получали стерильный физический раствор в объеме 2 мл. Для моделирования физической нагрузки использовали беговую дорожку для крыс «TSE Treadmill System GmbH» («TSE Systems International Group», Германия), (5 раз в неделю, 10 минут в день, скорость составила 25 м/мин). При эвтаназии методом цервикальной дислокации было проведено препарирование с визуальным осмотром печени, зафиксирована абсолютная масса органа и в пересчете на 100 г веса.

Гистологическое исследование проводилось по следующему алгоритму: печень погружалась в 10 % формалин, в дальнейшем из материала вырезались кусочки толщиной 2-3 мм, которые проводились по батарее изопропилового спирта и после заливались в парафиновые блоки. На микротоме изготавливались срезы толщиной 3-4 мкм, окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование и морфометрию проводили при помощи микроскопа Zeiss с цветной цифровой камерой. Подсчет морфометрических показателей осуществлялся с использованием компьютерной программы на 100 клеток в случайно выбранных полях зрения при увеличении 400х. В программе Zen 3.0 blue производили подсчет площади клетки и ядра, в MS Excel – площади цитоплазмы для дальнейшего вычисления ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО) по формуле:

где: S – площадь, мкм².

Статистическую значимость различий между средними арифметическими значениями по группам оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой на множественные сравнения, предварительно выборку проверяли на нормальность. Значимыми считали различия при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфометрическая оценка печени выявила достоверное повышение относительной массы печени у животных группы «Pb» (рисунок 1).

Рисунок 1. Относительная масса (на 100 г массы тела) печени крыс, подвергшихся сочетанному либо изолированному воздействию ацетата свинца и физической нагрузки. Значком «*» обозначены статистически значимые различия с группой «Контроль»

Гистоморфологическая картина печени контрольных животных соответствовала норме: гепатоциты полигональной формы, плазмолемма клеток просматривается слабо. Контуры ядер четкие, содержат 1-2 ядрышка, незначительная часть гепатоцитов долек – двуядерные. В то же время, в препаратах печени животных, получавших инъекции ацетата свинца, наблюдалось увеличение числа гепатоцитов, находящихся в состоянии гидропической и очаговой жировой дистрофий (рисунок 2). В группе, подвергавшейся физической нагрузке отмечаются одиночные лейкоциты в портальных зонах и в перисинусоидальном пространстве.

Рисунок 2. Гистологическая картина печени крыс: А – «Контроль», Б –  «Pb», В – «ФН», Г – «Pb+ФН». Красными стрелками обозначены двуядерные гепатоциты, синей – жировое включение в гепатоците. Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400х.

По результатам морфометрической оценки печени у животных группы «Pb» выявлено статистически значимое увеличение (на 65 %) количества двуядерных гепатоцитов, а также количества клеток с жировыми включениями (на 60 %) по сравнению с группой «Контроль». При этом статистически значимое увеличение количества жировых включений (в 4 раза) показано в группе «Pb+ФН». Стоит отметить, что у крыс, получавших только физическую нагрузку, выявлено снижение количества макрофагов Купфера (на 19 %). Тенденция к увеличению значения ЯЦО видна в обеих группах, подверженных воздействию ацетата свинца («Pb» и «Pb+ФН»), по сравнению с контролем данный показатель увеличился на 9,5 % и 71 % соответственно (рисунок 3).

Рисунок 3. Гистоморфологические показатели печени крыс, подвергшихся сочетанному либо изолированному воздействию ацетата свинца и физической нагрузки. Значком «*» обозначены статистически значимые различия с группой «Контроль»

ОБСУЖДЕНИЕ

Печень выступает критическим органом, осуществляющим метаболизм ксенобиотиков, что делает ее мишенью для накопления тяжелых металлов и их соединений, этим может быть опосредован тот комплекс гистоморфологических нарушений, который мы наблюдали после субхронического внутрибрюшинного воздействия ацетата свинца на крыс. Возрастание относительной массы печени согласуется с исследованиями других авторов и, как правило, объясняется аккумуляцией металла в печеночной ткани [5] и развитием отека [6].

Статистически значимое увеличение числа гепатоцитов с жировыми включениями в группах с экспозицией к ацетату свинца является типичным маркером интоксикации тяжелыми металлами [7], вызывающей свободнорадикальное повреждение печени, которое в результате приводит к развитию жировой дистрофии. Есть данные, подтверждающие связь между усилением окислительного стресса и появлением клеток с жировыми включениями [8]. Достоверное возрастание числа двуядерных гепатоцитов в группе «Pb» может быть связано с важной ролью таких клеток в адаптации к печеночному повреждению [9]. К тому же хорошо известно, что свинец может самостоятельно вызвать повреждение ДНК, соответственно, влияя на процессы деления клеток [10]. Исходя из того, что печень обладает колоссальной репаративной способностью, полученные нами результаты можно интерпретировать, как клеточный ответ на свинцовую интоксикацию.

Похожая тенденция отмечена после морфометрической оценки ЯЦО, которое показывает состояние клетки и ее метаболизма. В группах «Pb» и «Pb+ФН» прослеживается четкое увеличение данного показателя по сравнению с контролем. Учитывая тот факт, что данный показатель в норме должен быть меньше 1, можно говорить только о начальных стадиях нарушения функциональной активности клеток печени. Важно подчеркнуть, что на фоне физических упражнений количество жировых включений в клетках печени значительно возросло. Эти результаты могут свидетельствовать об усилении негативных эффектов свинца и активизации окислительных процессов в условиях [11].

ВЫВОДЫ

После проведения субхронического эксперимента и гистоморфологической оценки печени экспериментальных крыс нами были обнаружены негативные изменения животных во всех опытных группах. Субхронический эксперимент с введением ацетата свинца в разовой дозе 11 мг/кг м.т. оказывает отрицательные эффекты на ткань печени, которые усиливаются на фоне физической нагрузки.

Патоморфологические изменения показаны развитием гидропической и очаговой жировой дистрофиями, также визуально увеличилось количество полиплоидных (а именно двуядерных) клеток печени. Последнее было подтверждено и после проведения количественной оценки печени, которая показала статистически значимое увеличение данного показателя в группе «Pb». Также отмечено две тенденции – изменение ядерно-цитоплазматического индекса и увеличение количества жировых включений в гепатоцитах опытных групп («Pb» и «Pb+ФН»). Ввиду того, что ЯЦО, отражающее процессы метаболизма клетки, увеличилось незначительно, мы можем говорить лишь о начальных стадиях преждевременного старения клеток. Стоит отметить, что на фоне физической нагрузки процент клеток с жировыми включениями значительно вырос. Такие результаты могут говорить об усилении негативных эффектов свинца в сочетании с физической нагрузкой, при которой может происходить усиление окислительных процессов.

Причинами данных изменений могут быть специфические свойства свинца, заключающиеся в способности накапливаться в органах, влиять на процессы клеточного деления и вызывать тяжелые токсические повреждения, в том числе обусловленные нарушениями структуры ДНК, а также способствовать запуску процессов свободнорадикального окисления.     

Список литературы:

1. Измеров, И.Ф. Национальное руководство по профессиональным болезням / И. Ф. Измеров - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 723 с.
2. Титов, Е.А. Альтерация ткани головного мозга и печени белых крыс при свинцовой интоксикации в динамике эксперимента / Е.А. Титов, Н.Л. Якимова, М.А. Новиков / /Гигиена и санитария. – 2018. – №10. – С. 976-978.
3. Морфофункциональная характеристика ядер гепатоцитов мышей при сочетанном применении ацетата свинца и альфа-токоферола / Е.И. Купша, Л.Л. Алиев, С.В. Харченко, Е.Ю. Шаповалова // МНИЖ. – 2017. – №12. – С. 115-118.
4. Купша, Е.И. Морфологические признаки гипоксий в печени белых мышей при длительном пероральном поступлении малых доз ацетата свинца в организм / Е.И. Купша, В.В. Бондаренко // Здоровье – основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. – 2014. – №1. – С. 136-140.
5. Excessive dietary lead reduces growth performance and increases lead accumulation in pigs / H. Choi, S. Y. Ji, H. Jo [et al.] //  Anim Biosci. – 2021. – № 34 (1). – P. 102-108.
6. Киреева, Ю.В. Морфологические изменения печени при интоксикации свинцом / Ю. В. Киреева, О. С. Шубина // Фундаментальные исследования. – 2006. – № 1 – С. 104-105
7. The "bioeffect assessment index" (BAI). A concept for the quantification of effects of marine pollution by an integrated biomarker approach / K. Broeg, H. V. Westernhagen, S. Zander [et al.] // Mar Pollut Bull. – 2005. – № 50 (5). – P. 495-503.
8. Роль свободнорадикального перекисного окисления липидов в механизме развития жировой дистрофии печени рыб при выращивании на искусственных кормах / А.Д. Кобылинская, А.В. Сахаров, А.А. Макеев [и др.] // Вестник КрасГАУ. – 2013. – №3. – С. 123-128.
9. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury / P. D. Wilkinson, F. Alencastro, E. R. Delgado [et al.] // Am J Pathol. – 2019. - № 189 (6). – P. 1241-1255.
10. Goldstein, G. W. Lead poisoning and brain cell function / G. W. Goldstein // Environ Health Perspect. – 1990. – №89: – Р. 91–94.
11. Effect of Different Exercise Modalities on Oxidative Stress: A Systematic Review / A. Thirupathi, M. Wang, J. K. Lin [et al.] // Biomed Res Int. – 2021. – № 2021. – P. 1947928.