ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ОСПЫ ОВЕЦ НА НОВОМ КЛЕТОЧНОМ СУБСТРАТЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК VERO

Kurmet Koshemetov

master, production shop operator LLP «OtarBioPharm»,

Zhambyl region, Korday district, Gvardeyskiy uts.

Nazym Yessimbekova

master, production shop operator LLP «OtarBioPharm»,

Zhambyl region, Korday district, Gvardeyskiy uts.

Dauren Beishebaev

production shop operator LLP «OtarBioPharm»,

Zhambyl region, Korday district, Gvardeyskiy uts.

Bakhytzhan Olzhas,

production shop operator LLP «OtarBioPharm»,

Zhambyl region, Korday district, Gvardeyskiy uts.

Dastan Kaysenov

 master, production department manager LLP «OtarBioPharm»,

Zhambyl region, Korday district, Gvardeyskiy uts.

Zakir Ershebulov

 PhD, director  LLP «OtarBioPharm»,

Zhambyl region, Korday district, Gvardeyskiy uts.

АННОТАЦИЯ

Проведена адаптация штамма «НИСХИ» вируса оспы овец к перевиваемой культуре клеток Vero путем последовательного пассирования без потери основных свойств вируса. Впервые показана возможность применения сертифицированной Всемирной Организацией Здравоохранения перевиваемой культуры клеток Vero в приготовлении вакцины против оспы овец в условиях отечественного производства. Оптимизирован метод приготовления вакцины на новом клеточном субстрате, обеспечивающий получение по стандартной и производительной технологии вакцину против оспы овец.

ABSTRACT

Adaptation of the sheep pox virus strain "НИСХИ" to the transplanted Vero cell culture was carried out by sequential passivation without loss of the main properties of the virus. For the first time, the possibility of using a Vero culture of transferable cells certified by the World Health Organization in the preparation of a vaccine against sheep pox of domestic production has been shown. The method of preparation of the vaccine on a new cellular substrate has been optimized, which ensures the receipt of a vaccine against sheep pox using standard and productive technology.

Ключевые слова: культуpa клетoк Vero, вирус, штамм, оспа овец, вакцина, оптимизация.

Keywords: Vero cell culture, virus, strain, sheep pox, vaccine, optimization.

Введение

Оспа мелких жвачных животных является особо опасной инфекцией, возбудителем которые являются ДНК-содержащие эпителиотропные вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus. Оспа характеризуется лихорадкой, явлениями интоксикации, развитием на коже и слизистых оболочках папулезно-пустулезной сыпи, высокой смертностью животных, особенно молодняка [1].

Заболевание, вызываемое вирусом оспы овец, имеет довольно широкий географический ареал распространения и является постоянной угрозой овцеводству многих стран, нанося ощутимый экономический ущерб во время эпизоотий. Заболеваемость при оспе овец колеблется от 20 до 90%, а летальность в зависимости от породы, возраста животных и формы течения болезни может достигать 50-100%, поэтому, в профилактике оспы овец важное значение имеет специфическая профилактика, которая осуществляется с помощью вакцин [2].

В Казахстане используется сухая культуральная вирусвакцина против оспы овец, которая разработана учеными Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности (НИИПББ) [3]. Данная вакцина содержит активное вещество в виде антигенного материала из вакцинного штамма «НИСХИ», полученного в первичной культуре клеток ПЯ (почки ягненка) с титром инфекционной активности 5,0±0,5 lg ТЦД₅₀/см³, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении 1:1.

Недостаток методов изготовления этой вакцины состоит в том, что она представляет собой тканевую суспензию, и приготовливается в первичной культуре клеток, выращенной в лабораторных матрасах, стационарным методом.

Другим недостатком прототипа является то, что ампулы с вакциной запаивают на карусельно-коллекторном аппарате с помощью специальных горелок, работающих на кислородно-пропановой смеси, которая усложняет работу персонала и технологию производства.

Главным минусом метода приготовления вакцины в современных условиях производства это применение дорогостоящих технологических процессов, предусматривающей приобретение вирусного материала в первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягнят.

Приобретение клеточного субстрата связано с сезонностью, возможностью контаминации его посторонней микрофлорой и невыгодным применением молодых ягнят, что приводит к огромным расходам на получение промышленных серий культуры клеток и увеличивает себестоимость биологических препаратов.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в ходе отбора и исследования разных гетероплоидных клеточных линий с целью приготовления вирусных вакцин рекомендовала перевиваемую культуру клеток Vero (почки африканской зеленой мартышки). Это клеточная культура имеет достаточное преимущество перед первично-трипсинизированными культурами клеток животных и человека, т.к. соответствует предъявляемым нынешним условиям по параметрам отсутствия разных контаминирующих агентов, в том числе и онкогенных [4].

В связи с этим, перед нами была поставлена цель оптимизировать технологию получения сухой культуральной вакцины против оспы овец из штамма «НИСХИ» с применением нового субстрата - перевиваемой линии клеток Vero и автоматической линии розлива.

Материалы и методы.

В начале исследования провели адаптацию вируса оспы овец из штамма «НИСХИ» к перевиваемой культуре клеток Vero. Адаптацию данной культуры клеток к штамму вируса проводили в 5-ти последовательных пассажах. Для инфицирования клеток использовали вируссодержащую суспензию матричной расплодки вируса оспы овец в дозе 0,05-0,06 ТЦД₅₀ на клетку с биологической активностью 5,0±0,25 lg ТЦД₅₀/см³.

Для проведения очередного пассажа содержимое матрасов, с культурой клеток, инфицированных вирусом оспы овец, в сроки максимального развития ЦПД вируса (80-90%) на монослое клеток, замораживали при минус (40±1)°С в течение 18-20 часов, размораживали при температуре (20±2)°С, объединили в одну емкость и полученную суспензию после проверки на стерильность, использовали для заражения свежей аналогичной культуры клеток. Методика исследования на втором и последующих пассажах аналогична методике первого пассажа. Учет цитопатического действия вируса (ЦПД) проводили через каждые 24 часа.

Далее определяли биологическую активность штамма после адаптации к новому субстрату в сравнении с показателями инфекционной активности в первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягненка (ПЯ). Титр вируса выражали в lg ТЦД_50/см3 и рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [5].

Изготовления вакцины против оспы овец из штамма «НИСХИ», осуществляли в культуре клеток почек африканской зеленой мартышки (Vero) в роллерных (5,0 л.) сосудах при температуре 37,0±0,5 °С с добавлением в полученную вирусную суспензию защитной среды, включающей пептон и сахарозу в соотношении 1:1 с добавлением раствора гентамицина 2,5 мкг/мл, с последующим лиофильным высушиванием.

Разливку и лиофилизацию вакцины проводили на автоматической линии розлива и лиофильной машине согласно требованиям международного стандарта надлежащей производственной практики (GMP). Флаконы автоматически закрываются резиновыми пробками и алюминиевыми крышками на машинах lyophilization and capping.

Результаты и обсуждения.

Проведена адаптация штамма «НИСХИ» вируса оспы овец к культуре перевиваемых клеток Vero путем последовательного пассирования без потери основных свойств вируса. Вирус оспы овец репродуцируется в исследуемой культуре клеток и на 2-е сутки культивирования уже были отмечены первые признаки деструктивных изменений клеток, а на 6-7 сутки обнаруживалось практически полное разрушение клеточного пласта. Наличие и титр вируса инфицированных материалов определяли в культуре клеток Vero по общепринятой методике титрования. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Определение биологической активности вируса оспы овец из штамма «НИСХИ» в перевиваемой культуре клеток Vero

Как  видно из данных таблицы, при заражении штаммом «НИСХИ» вируса оспы овец титр вируса в культуре клеток Vero на первом пассаже составил 4,75 lg ТЦД₅₀/см³, которое в дальнейшем повысилось до 5,50 lg ТЦД₅₀/см³. Репродукция вируса в этой клеточной культуре оставалось стабильной при проведении 5-ти последовательных пассажей.

Применение данной клеточной культуры дает возможность устранить из технологического процесса дорогостоящую, мало технологичную первичную культуру клеток почки ягненка. Впервые показана возможность применения сертифицированной Всемирной Организацией Здравоохранения перевиваемой культуры клеток Vero в приготовлении вакцины против оспы овец в условиях отечественного производства.

Таким образом, полученные данные позволяют считать перспективным использование нового клеточного субстрата для репродукции вируса оспы овец и автоматическую линию розлива, которая обеспечивает получение вакцины по стандартной и производительной технологии, а также упрощает работу персонала, технологию производства. Он прост в исполнении, доступен и может быть реализован в промышленном масштабе в условиях ТОО «OtarBioPharm» в соответствии с требованиями международного стандарта надлежащей производственной практики (GMP).

Заключение

Оптимизирована технология производства вакцины против оспы овец из штамма «НИСХИ» на новом клеточном субстрате - перевиваемой линии клеток Vero. На способ изготовления вакцины подана заявка на полезную модель.

Список литературы:

1. Кореба О.А. Биологические свойства штаммов вируса оспы овец // Дисс. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. п.г.т. Гвардейский 1984.
2. Сейткасымов Б.К., Курченко Ф.П., Алехина С.Г., Симановская О.С. Изучение влияния различных факторов на накопление штамма ²НИСХИ² вируса оспы овец в культуре клеток // Вопросы защиты сельскохозяйственных растений и животных от болезней. Ч.2. Алма-Ата. 1989. – С.18.
3. Курченко Ф.П., Иванющенков В.Н., Уфимцев К.П. и др. Эффективность сухой вирусвакцины из штамма НИСХИ против оспы овец// Ветеринария, 1991.-№10.-С.21-23.
4. Подчерняева Р.Я., Хижнякова Т.М., Михайлова Г.Р., Шалунова Н.В., Петручук Е.М., Бердникова З.Е. Линия клеток Vero (B) для приготовления медикобиологических препаратов // Вопросы вирусологии. — 1996. — Т. 4. — С. 183—185.
5. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. https://search.rsl.ru/ru/record/01005954123.