ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕДЕНИЯ КРЫС САМЦОВ В ТЕСТЕ «ТЕМНО-СВЕТЛАЯ КАМЕРА» ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ АНТАГОНИСТА Р-234 КИССПЕПТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ РЕЖИМОВ ОСВЕЩЕНИЯ.

Margarita Zhuravleva

training master of the department of human and animal physiology, Samara university,

Russia, Samara

АННОТАЦИЯ

В статье приводятся исследования антагониста р-234 кисспептиновых рецепторов при интраназальном введении в стандартном поведенческом тесте темно-светлая камера в условиях изменения режимов освещения. Основной проблемой является повышение адаптации организма человека к действию различных факторов среды обитания. Цель исследования определить адаптогенную активность у крыс при блокаде рецепторов. Задачи в экспериментах in vivo выявить паттерны эмоционально-поведенческих реакций крыс. Для этого будут определено количество заходов в темный отсек.

ABSTRACT

The article presents studies of the p-234 antagonist of kisspeptin receptors when administered intranasally in a standard behavioral test of a dark-light chamber under conditions of changing lighting modes. The main problem is to increase the adaptation of the human body to the action of various environmental factors. The aim of the study was to determine the adaptogenic activity in rats during receptor blockade. Tasks in in vivo experiments to identify patterns of emotional and behavioral reactions of rats. To do this, the number of visits to the dark compartment will be determined.

Ключевые слова: кисспептин, интраназальное введение, биологические ритмы, супрахиазматическое ядро гипоталамуса.

Keywords: kisspeptin, intranasal administration, biological rhythms, suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus.

Ген KISS1 изначально был впервые определен как белок отвечающий за подавление метастазирования. В 1996 году его выделили из меланомы человека [1, р. 1733]. KISS1 был идентифицирован в плаценте как эндогенный лиганд GPR54, так как является 54-аминокислотным пептидом. Рецептор данного белка относится к G-типу. Открытие рецептора произошло в 2001 году [2, р. 1762]. Кисспептин состоит из 52-54 аминокислот у млекопитающих [3, р. 845]. С-концевая 10-аминокислотная последовательность, связывающаяся с GPR54 идентична у млекопитающих кроме приматов [4, р. 3050]. Тирозин на С-конце у приматов изменяется на фенилаланин. У человека кисспептин активирует внутриклеточную сигнализацию проявляя мощное связывающее сродство к GPR74 и GPR147 [5, р. 2]. Роль сигнализации GPR54 кисспептина в начале полового созревания была обнаружена благодаря GPR54 с потерей функции. Данное нарушение проявляется ввиде гипогонадотропного гипогонадизма и пубертатной недостаточности [6, р. 1792]. Позже были создан генномодифицированные мыши с нокаутом Gpr54 успешно воспроизводящие фенотип человеческой мутации GPR54 [7, р. 361]. Выявленные механизмы показали роль GPR54 и его лиганда в процессе полового созревания. Первой линии мышей с накаутом Gpr54 была выявлена активность β-галактозидазы. В нейронах GnRH β-галактозидаза представляет экспрессию GPR54. Поэтому, кисспептин представляет собой важнейший пептид, контролирующий ГнРГ. Действительно, стимуляция кисспептином или его амидированным декапептидом Kp-10 секреции ганадотропина происходит через ГнРГ. У крыс с накаутом по Kiss1 не наблюдалось импульсов секреции ЛГ ФСГ, а также были обнаружены дефекты полового созревания. Выявленные механизмы доказывают необходимость секреции кисспептина в генерации тонической и циклической секреции ГнРГ. Данные исследования сыграли незаменимую роль в определении регуляции наступления полового созревания и нормальной репродуктивной функции. [8, р. 1].

Однако, не изученным остается влияние кисспептина, а также его антагониста на супрахиазматическое ядро гипоталамуса. Биологические ритмы являются важным механизмом, регулирующим сон/бодрствование, метаболизм и многие другие аспекты поведения человека и млекопитающих. В данной работе проводится исследование поведения крыс самцов Вистар при интраназальном введении антагниста р-234 кисспептиновых рецепторов в условиях изменения режимов освещения.

Материалы и методы исследования

В исследовании рассматривается влияние блокады кисспептиновых рецепторов на проявление эмоционально-поведенческих реакций крыс in vivo в стандартном поведенческом тесте «темно-светлая камера». Данный раздел работы выполнен на крысах самцах Вистар (массой 240-270 грамм), имеющейся на кафедре физиологии человека и животных Самарского национального исследовательского университета им. академика С.П.Королёва. Данная тест-система входит в перечень установок для выполнения психофармакологических тестов согласно приказу Минздрава России, N 281 от 30.04.2013. В начале теста крыса помещалась в тёмный отсек. В течение 10 мин. регистрировалось количество заходов в темный отсек.

Исследование произведено на контрольной и экспериментальной группах животных. Крысам контрольной группы произведено закапывание в нос воды в соответствии с графиком для экспериментальной группы. Животным экспериментальной группы интраназального введен антагонист р-234 кисспептина троекратно (в течение трёх последовательных суток) в каждый из следующих шести моментов циркадиан-ного цикла: ZT 2, 6, 10, 14, 18 и 22 часа (ZT = 0 соответствует моменту включения освещения при световом режиме свет/темнота 12 : 12 часов). Экспериментальная методика интраназального введения антагониста р-234 кисспептина дает возможность его быстрого проникновения непосредственно в головной мозг в значительной концентрации вдоль обонятельных и тройничных нервов, минуя гематоэнцефалический барьер. При этом вводимое вещество практически не попадет в кровоток, что даёт возможность изучать центральные эффекты вещества изолировано от его периферических, возникающих при системном введении. Через 15 мин. после интраназального введения антагониста р-234 кисспептина крыса помещалась в установку и в течение 10 мин. производилась видео регистрация поведенческих паттернов. Для регистрации перемещений животных осуществлялся видео-трекинг с использованием камеры Panasonic fullhd hc-x810 установленной на штатив. Полученные данные обработаны при помощи статистической программы SigmaPlot.

Результаты исследования

При сравнении поведения крыс в контрольной и экспериментальной группах в тесте «темно-светлая камера» в условиях интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 в различные моменты циркадианного цикла обнаружены следующие особенности.

Активность животных контрольной и экспериментальной групп, зарегистрированная при применении антагониста в субъективные дневные часы (ZT 2, ZT 6 и ZT 10) и субъективные ночные (ZT 14, ZT 18 и ZT 22) оказалась неодинаковой. Поведение животных, в частности, характеризовалось снижением количества заходов в темный отсек в экспериментальной группе при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 в субъективное дневное время ZT 2 по сравнению с контрольной группой (P = 0,044). В отличие от этого значение данного параметра в экспериментальной группе превышало контрольное после введения антагониста в ZT 6 (P = 0,006). Введение вещества в момент циркадианного цикла ZT 10 не приводило к изменениям данного показателя относительно контроля (P = 0,333).

Обсуждение результатов исследования

В поведенческих экспериментах изучено влияние специфического антагониста р-234 кисспептиновых рецепторов на поведение самцов крыс в стандартном тесте «темно-светлая камера» при интраназальном введении антагониста в различные моменты субъективного суточного цикла. В настоящей работе были проанализированы важнейшие показатели поведенческой активности животных в установке «темно-светлая камера»: количество заходов в темный отсек.

В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что блокада кисспептиновых рецепторов при помощи р-234 в специфические моменты субъективного суточного цикла приводит к снижению уровня тревожности, стимулирует проявления исследовательского поведения и локомоторной активности. При этом обнаруженные эффекты антагониста как правило проявляются при его воздействии в субъективное дневное время суток. Такая специфичность периодов фармакологической активности исследуемого вещества может быть связана с циркадианными изменениями уровня экспрессии кисспептиновых рецепторов, либо функциональной активности соответствующих внутриклеточных каскадов в структурах-мишенях.

Список литературы:

1. Lee J. H. KiSS-1, a novel human malignant melanoma metastasissuppressor gene / Jeong-Hyung Lee, Mary E. Miele, Deana J. Hicks, Karen K. Phillips, Jeffery M. Trent, Bernard E. Weissman, Danny R. Welch // J Natl Cancer Inst. – 1996. 88(23). P.1731-1737.
2. Sophie Messager. Kisspeptin directly stimulates gonadotropin-releasing hormone release via G protein-coupled receptor 54 / Sophie Messager, Emmanouella E. Chatzidaki, Dan Ma, Alan G. Hendrick, Dirk Zahn, John Dixon, Rosemary R. Thresher, Isabelle Malinge, Didier Lomet, Mark B. L. Carlton, William H. Colledge, Alain Caraty, and Samuel A. J. R. Aparicio // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2005. 102(5). P.1761-1766.
3. Gorbunova O. L. Role of Kisspeptin in Regulation of Reproductive and Immune Reactions / Gorbunova O. L., Shirshev S. V. // Biochemistry (Moscow). – 2020. Volume 85. P.839–853.
4. James P Garcia. Role of Kisspeptin and Neurokinin B Signaling in Male Rhesus Monkey Puberty / James P Garcia, Kim L Keen, Brian P Kenealy, Stephanie B Seminara, Ei Terasawa // Endocrinology. - 2018. Volume 159. Issue 8. P. 3048–3060.
5. Mika Kiyohara. Involvement of gonadotropin-inhibitory hormone in pubertal disorders induced by thyroid status / Mika Kiyohara, You Lee Son, Kazuyoshi Tsutsui // Scientific Reports. – 2017. volume7. Article number: 1042.
6. Andrew A. Trial of Recombinant Follicle-Stimulating Hormone Pretreatment for GnRH-Induced Fertility in Patients with Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism / Andrew A. Dwyer, Gerasimos P. Sykiotis, Frances J. Hayes, Paul A. Boepple, Hang Lee, Kevin R. Loughlin, Martin Dym, Patrick M. Sluss, William F. Crowley, Nelly Pitteloud // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. – 2013. Volume 98. Issue 11. P. 1790–1795.
7. Hua Mei.  Gpr54−/− mice show more pronounced defects in spermatogenesis than Kiss1−/− mice and improved spermatogenesis with age when exposed to dietary phytoestrogens / Hua Mei, Cara Walters, Richard Carter, and William H Colledge// Reproduction. – 2011. 141(3). P.357-366.
8. Tianming Wang. Existence and functions of a kisspeptin neuropeptide signaling system in a non-chordate deuterostome species / Tianming Wang , Zheng Cao, Zhangfei Shen, Jingwen Yang, Xu Chen , Zhen Yang, Ke Xu, Xiaowei Xiang, Qiuhan Yu, Yimin Song, Weiwei Wang, Yanan Tian, Lina Sun, Libin Zhang, Su Guo, Naiming Zhou // Elife. -  2020. 9. e53370.