ЦИНК В СОСТАВЕ ПРЕПАРАТА «ГОНАДОТРОПИН ХОРИОНИЧЕСКИЙ, 1000 МЕ»

ZINC IN THE STRUCTURE OF THE DRUG “HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN, 1000 IU”

Elena Budko

doctor of Pharmaceutical Sciences, head of the Department of General and Bioorganic Chemistry, Ph.D., Professor of Kursk State Medical University,

Russia, Kursk

Leonid Yampolsky

candidate in Chemistry, assistant professor of head of the Department of General and Bioorganic Chemistry, Kursk State Medical University,

Russia, Kursk

Eugene Fedorov

assistant of the Department of General and Bioorganic Chemistry, Kursk State Medical University,

Russia, Kursk

Anatoly Khabarov

doctor of Pharmaceutical Sciences, Ph.D., Professor of the Department of General and Bioorganic Chemistry, Kursk State Medical University,

Russia, Kursk

АННОТАЦИЯ

Проведено исследование препарата «Гонадотропин хорионический, 1000 МЕ» производства ФГУП «Московский эндокринный завод» на содержание включенных в структуру ХГЧ атомов цинка. Исследование образцов минерализата нативного хорионического гонадотропина показало наличие в составе одной молекулы ХГЧ 9–17 атомов цинка. Дублирующие измерения методами инверсионной вольтамперометрии и ИСП-МС дают высокую степень совпадения.

ABSTRACT

A study of drug «Chorionic gonadotropin, 1000 IU» produced by FSUE “Moscow Endocrine Plant” on the content included in the structure of hCG zinc atoms. Study samples mineralisated native chorionic gonadotropin showed the presence in one molecule hCG 9–17 zinc atoms. A duplicate measurement by stripping voltammetry and ICP-MS gives a high degree of coincidence.

Ключевые слова: Цинк; хорионический гонадотропин человеческий (ХГЧ); инверсионная вольтамперометрия; минерализация.

Keywords: Zinc; human chorionic gonadotropin (hCG); zinc; inversion voltammetry; mineralization.

Уровень хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) считается одним из наиболее информативных показателей состояния развития плода: его увеличение происходит при токсикозе, сахарном диабете, синдроме Дауна; уменьшение его содержания говорит о возможной внематочной беременности, задержке в развитии плода, угрозе его гибели и самопроизвольном прерывании беременности. С другой стороны, патологии беременности и развития ребенка связывают со снижением уровня цинка [1, с. 64]. Нами в предыдущих работах выявлена корреляция между содержанием общего цинка и хорионического гонадотропина в крови беременных с риском невынашивания в первом триместре [2, с. 180].

Принципиальная возможность влияния цинка на активность ХГЧ [6, с. 300] и стабильность его структуры [5, с. 1] уже рассматривалась. Однако вопрос о возможности непосредственного взаимодействия гормона с цинком остается открытым. Поэтому, изучение возможного содержания цинка в препарате «Гонадотропин хорионический, 1000 МЕ лиофилизат», представляет интерес.

В анализе микроколичеств металлов в сложных системах часто применяются масс-спектроскопия и инверсионная вольтамперометрия. Оба метода обладают высокими аналитическими характеристиками и могут быть использованы в дублирующих опытах. Выбор метода ИВА определяется сочетанием возможности количественного анализа и изучения форм нахождения частиц в исследуемой среде [3, с. 277]. Все это делает инверсионную вольтамперометрию перспективной в изучении состояния металлов в биологических системах.

В качестве объекта исследования использован лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения «Гонадотропин хорионический, 1000 МЕ» производства ФГУП «Московский эндокринный завод», представляющий собой нативный ХГЧ, полученный из мочи беременных женщин методом осаждения с последующей очисткой на ионитах. Активное вещество – гонадотропин хорионический 1000 ЕД, вспомогательное вещество – маннитол 20 мг.

Минерализацию проводили в программируемом комплексе для пробоподготовки «Темос-Экспресс» ТЭ-1 (ООО ИТМ, Россия) при рабочих температурах 220 и 120^оС (погрешность ±10^оС) в течение 1 час и 30 минут соответственно. Контроль рН растворов осуществляли с помощью рН метр/иономера ИТАН ООО «НПП «Томьаналит». Погрешность при определении рН ± 0,05.

Для приготовления растворов использовалась дистиллированная вода ГОСТ 6709-72 с последующей деионизацией (деионизатор «Водолей» НПП Химприбор), электропроводность 18,2 МОм´см². Рабочие растворы цинка готовили в соответствии с ГОСТ Р 51301-99 разбавлением ГСО «Цинк» ГОСТ 8053-94, «ЦСОВВ».

Предварительную пробоподготовку проводили методом мокрого озоления концентрированной хлорной кислотой (хлорная кислота 65 % ГОСТ 6552-80 «Алтайхимпром») и пероксидом водорода («ХЧ», 30 % ГОСТ 177-88 ООО «Лега») в соответствии с методикой МУ 31-41/09 «Количественный химический анализ проб крови и биологических жидкостей» с учетом ГОСТ Р 51301-99. Минерализат нейтрализовали аммиаком водным 25 %, ГОСТ 3760-79 ООО «МК Магна») до рН 4-5.Нейтрализованный минерализат разводили деионизированной водой и отбирали аликвоту.

«Холостая проба» представляет собой водный раствор набора реактивов для минерализации за исключением ХГЧ.

Методика инверсионно – вольтамперометрического исследования (ИВА) соответствует ГОСТ Р 51301-99 и МУК 4.1.742-99 «Инверсионное вольтамперометрическое измерение концентрации ионов цинка, кадмия, свинца и меди в воде». Дегазация аналита проведена встроенным ультрафиолетовым облучателем; в качестве фотоактивного вещества использована муравьиная кислота (85 % ГОСТ 5848-73 ООО «Спектр-Хим»), применяемая также в качестве фонового раствора (приготовлен согласно ГОСТ Р 51301-99).

Снятие сигнала осуществляли на трехэлектродной вольтамперометрической ячейке с амальгамным электродом ДПТА.02.0100 СБ; в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода использован хлорсеребряный ДПТА.01.0100 СБ.

Работы проводились под управлением программного обеспечения ТА-Lab для контроля экспериментов и сбора данных на ПК. Измерения выполнены в условиях одновременного получения трех результатов по одной пробес применением вибрационного перемешивания, автоматического расчета среднего значения, показателей повторяемости и точности анализа.

Регистрацию аналитических сигналов проводили при линейно-меняющемся потенциале от -1,2 до 0,1 В. Привязка пиков к химическим элементам на приборе ТА-Lab производится автоматически. Максимальное электрорастворение цинка с поверхности электрода наблюдается в диапазоне потенциалов Е_п=–0,9± 0,1 В. Потенциал накопления Е_н= -1,500 В; время накопления t = 45 сек, форма развертки – постояннотоковая, скорость развертки 80 мВ/с.

Контрольные измерения методом ИСП-МС проводили на приборе ELAN DRC II, производства компании “Perkin Elmer Corporation”. Методика исследования и реактивы соответствуют МУК 4.1.1483-03, режим сканирования: прыжки по пикам. Число измерений пика 14. Число параллельных измерений 3. Время пребывания на массе 30 мс. Время интегрирования 2000 мс. Чувствительность метода до 10^-9 – 10^-10 моль/л.

Инверсионно-вольтамперометрическое исследование (ИВА) проводилось на вольтамперометрическом анализаторе ТА-Lab (ООО «НПП «Томьаналит»). Идентификацию пиков проводили с использованием добавок рабочих растворов цинка. При добавлении аликвоты пробы к фоновому раствору на вольтамперограмме наблюдается пик при потенциале Е_п= – 0,9± 0,1 В. При введении добавки рабочего раствора цинка наблюдается кратное увеличение силы тока при постоянном значении Е_п.

Наличие цинка в деионизированной воде не превышает требований ГОСТ 6709-72. Исследование неминерализованной пробы методом ИВА показало отсутствие свободного цинка в препарате. В составе вспомогательного вещества – маннитол (CAS 87-78-5, SMQ, GMP) – цинк также не обнаружен.

Вольтамперограммы I(Е) регистрации аналитического сигнала цинка в «холостой пробе» и растворе минерализата ХГЧ представлены на рисунке 1. При введении добавки рабочего раствора цинка (кривая 3) наблюдается кратное увеличение силы тока при постоянном значении Е_п. «Холостая проба» показала наличие цинка, что объясняется присутствием примеси металла в кислотах, использованных для минерализации. Наличие цинка в минерализате ХГЧ показано на рисунке 2.

Рисунок 1. Инверсионные вольтамперограммы: фоновый раствор (1), холостая проба (2), добавка рабочего раствора цинка (3)

Рисунок 2. Инверсионные вольтамперограммы: фоновый раствор (1), проба-минерализат (2), добавка рабочего раствора цинка (3)

Проверка правильности результатов измерений проводилась методом «введено-найдено» с использованием модельных растворов цинка, составленных из «холостых проб» и рабочих растворов. Устойчивая воспроизводимость результатов сохраняется в диапазоне концентраций 1,00´10^-3 – 1,00´10^-7 г/л, промахи измерения отсутствуют. Методом добавок определена количество цинка в минерализате препарата ХГ (1000 МЕ) – 2,07´10^-8 моль.

Дублирующее исследование проводилось методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой (ИСП-МС). Анализ показал присутствие цинка в пробе минерализата ХГ (1000 МЕ) в количестве 4,03´10^-8 моль. Таким образом, двумя независимыми методами ИВА и ИСП-МС обнаружено наличие ионов цинка в составе лиофилизированного препарата «Гонадотропин хорионический, 1000 МЕ» производства ФГУП «Московский эндокринный завод» в количестве 9–17 атомов на молекулу ХГ.

В трехмерной структуре синтезированного ХГЧ [7, с. 545] неорганические составляющие не обнаружены, однако известно, что использование высокоочищенных гормонов и стероидов не всегда давало положительный лечебный эффект. Поэтому в терапевтических целях используют нативный гормон из мочи беременных женщин.

Высокая гидрофильность внешних аминокислот, значительное содержание сиаловой кислоты [4, с. 246] и наличие цистиновых узлов придает молекуле ХГ способность связывать и удерживать на своей поверхности положительно-заряженные частицы, например катионы цинка. Особенности структуры позволяют полимеру сохранять достаточно прочные связи с ионами при прохождении через стадии очистки при получении препарата (Патент США № 3852422, авторское свидетельство СССР № 537681, заявка Японии № 60-45852). Учитывая то, что структура ХГЧ при переходе из крови в мочу не претерпевает существенных изменений, можно утверждать, что в организме человека цинк входит в активную форму ХГЧ.

Выводы

Проведено исследование препарата «Гонадотропин хорионический, 1000 МЕ» производства ФГУП «Московский эндокринный завод» на содержание включенных в структуру ХГЧ атомов цинка.

Результаты экспериментов, проведенных методами инверсионной вольтамперометрии и ИСП-МС показали наличие ионов цинка в составе лиофилизированного препарата «Гонадотропин хорионический, 1000 МЕ» производства ФГУП «Московский эндокринный завод» в количестве 9–17 атомов на молекулу ХГ.

Наличие в структуре ХГ сиаловых кислот, наряду с представлениями о цистиновых узлах, говорит о возможном хелатном удерживании цинка в составе хорионического гонадотропина.

Список литературы:

1. Князева Т.П. Прогностическое значение определения содержания меди и цинка в плазме крови и волосах беременных женщин группы риска по невынашиванию беременности // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2005. – № 1.– С. 64–66.
2. Корреляция между содержанием общего цинка и хорионического гонадотропина в крови беременных с риском невынашивания в первом триместре / Будко Е.В. [и др.]. // Современная медицина: актуальные вопросы. – 2016. – № 54-55. – С. 171–181.
3. Майстренко В.Н. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. / Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. – М.: Химия, 1996. – 319 с.
4. Moyle W.R. Functional homodimeric glicoprotein hormones: implication for hormone action and evolution / W.R. Moyle, R.V. Myers, Y.H. Wang et al. // Chemistry and Biology. – 1998. – Vol. 5, № 5. – P. 241–251.
5. Patent US3852422 A, 03.12.1974.
6. Sakari Kellokumpu, Hannu Rajaniemi. Effect of Zinc on the Uptake of Human Chorionic Gonadotropin (hCG) in Rat Testis and Testosterone Response in vivo Biology of ReproductionMarch. – 1981. – Vol. 24, №. 2. – P. 298–305.
7. Structure of human chorionic gonadotropin at 2.6 A resolution from MAD analysis of the selenomethionyl protein. / Wu H. [and etc] // Structure. – 1994. –Vol. 15, № 2 (6). – P. 545–558.