ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ  ТОКСИЧНОСТЬ  КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫХ  БИОНОВ

Кутихин  Антон  Геннадьевич

младший  научный  сотрудник, 
федеральное  государственное  бюджетное  научное  учреждение  «Научно-исследовательский  институт  комплексных  проблем  сердечно-сосудистых  заболеваний», 
РФ,  г.  Кемерово

E-mail: 

ENDOTHELIAL  TOXICITY  OF  CALCIUM  PHOSPHATE  BIONS

Anton  Kutikhin

junior  Researcher, 
Research  Institute  for  Complex  Issues  of  Cardiovascular  Diseases, 
Russia,  Kemerovo

АННОТАЦИЯ

В  данной  работе  изучены  токсические  эффекты  кальций-фосфатных  бионов  по  отношению  к  эндотелиальным  клеткам.  Показано,  что  экспозиция  кальций-фосфатным  бионам  in  vitro  в  течение  суток  способствует  апоптозу  и  снижает  жизнеспособность  клеток  эндотелия,  а  также  способствует  выработке  интерлейкина-6  и  интерлейкина-8.  Кроме  того,  экспозиция  кальций-фосфатным  бионам  вызывает  гиперплазию  интимы  брюшной  аорты  крыс  in  vivo.  Данные  эффекты  могут  быть  обусловлены  интернализацией  кальций-фосфатных  бионов  эндотелиальными  клетками. 

ABSTRACT

Here  we  investigated  the  toxic  effects  of  calcium  phosphate  bions  on  endothelial  cells.  We  showed  that  exposure  to  calcium  phosphate  bions  in  vitro  during  24  h  promotes  apoptosis  and  reduces  viability  of  endothelial  cells.  In  addition,  it  enhances  production  of  interleukin-6  and  interleukin-8.  Moreover,  exposure  to  calcium  phosphate  bions  induces  intimal  hyperplasia  of  rat  abdominal  aorta  in  vivo.  These  effects  may  be  caused  by  internalization  of  calcium  phosphate  bions  by  endothelial  cells. 

Ключевые  слова:  бионы;  атеросклероз;  эндотелий;  токсичность.

Keywords:  bions;  atherosclerosis;  endothelium;  toxicity.

Введение

Бионы  представляют  собой  биомиметические  минерало-органические  наночастицы  из  различных  солей  и  фосфатов  и  являются  физиологическим  механизмом,  регулирующим  функцию,  транспорт  и  выведение  элементов  и  минералов  в  организме  человека  [8,  с.  e75501].  Кальций-фосфатные  бионы  формируются  в  биологических  жидкостях  организма  при  избытке  преципитирующих  ионов  кальция  и  фосфора  или  их  безуспешном  выведении  [8,  с.  e75501].  На  данный  момент  остается  непонятным,  являются  ли  кальций-фосфатные  бионы  токсичными  для  организма  либо  это  всего  лишь  безвредный  продукт  фосфорнокальциевого  гомеостаза.  Было  предположено,  что  кальций-фосфатные  бионы  могут  быть  токсичными  для  эндотелиальных  клеток. 

Материалы  и  методы

Для  искусственного  синтеза  кальций-фосфатных  бионов  готовились  базовые  растворы  CaCl₂  и  Na₂HPO₄*12H₂O,  которые  далее  разбавлялись  до  равных  концентраций  в  1  мМ  во  флаконе  с  10  мл  культуральной  среды  (среда  DMEM,  10  %  фетальная  бычья  сыворотка,  1  %  раствор  L-глутамина-пенициллина-стрептомицина  и  0,4  %  раствор  амфотерицина  B)  и  инкубировались  при  37  °C,  5  %  CO₂  и  высокой  влажности.  Все  процедуры  осуществлялись  в  стерильных  условиях.  Длительность  культивирования  составила  6  недель,  после  чего  растворы  инкубировались  в  течение  3  дней  при  4°  C,  центрифугировались  при  200000  x  g  в  течение  1  ч  при  4  °C,  и  осадок  растворялся  в  фосфатно-солевом  буфере.  Количество  кальций-фосфатных  бионов  в  растворе  определялось  измерением  оптической  плотности  (ОП)  на  длине  волны  650  нм  в  соответствии  со  стандартами  МакФарланда  (0,5,  1  и  2  МкФ  с  соответствующими  значениями  ОП  0,08–0,10,  0,14–0,17  и  0,27–0,31). 

Для  экспериментов  с  клетками  использовалась  эндотелиальная  клеточная  линия  EA.hy  926.  Клеточная  линия  EA.hy  926  является  гибридомой,  которая  была  получена  путем  слияния  эндотелиальных  клеток  пупочной  вены  человека  с  клетками  аденокарциномы  легкого  линии  A549  и  сохраняет  основные  морфологические  и  функциональные  особенности  венозных  эндотелиальных  клеток  человека  [2,  с.  3736].  Клетки  культивировались  в  среде  DMEM/F12  (с  10%  фетальной  телячьей  сывороткой,  2  %  раствором  гипоксантина-аминоптерина-тимидина,  1  %  раствором  HEPES-буфера,  1  %  раствором  L-глутамина-пенициллина-стрептомицина  и  0,4  %  раствором  амфотерицина  B.  Все  эксперименты  с  клетками  проводились  в  стерильных  условиях  при  37  °C,  5  %  CO₂  и  высокой  влажности.

Для  анализа  интернализации  кальций-фосфатных  бионов  клетки  EA.hy  926  в  6-луночных  планшетах  (2*10⁵  клеток  на  лунку)  экспонировались  100  мкл  кальций-фосфатных  бионов  (2  МкФ)  или  фосфатно-солевому  буферу  в  течение  48  ч.  Осадок  клеток  фиксировался  в  течение  1  ч  2,5  %  глутаровым  альдегидом,  постфиксировался  в  течение  1  ч  1  %  тетраоксидом  осмия,  заключался  в  2  %  агарозу  и  обезвоживался  в  батарее  спиртов  возрастающей  концентрации.  Срезы  агарозного  геля  заключались  в  смесь  эпоксидной  смолы  и  ацетона  (соотношение  1:1)  при  комнатной  температуре  на  2  ч,  затем  снова  заключались  в  эпоксидную  смолу  при  комнатной  температуре  на  сутки,  и,  наконец,  заключались  в  свежую  эпоксидную  смолу.  Ультратонкие  срезы  производились  на  ультрамикротоме,  помещались  на  медную  сеточку  с  углеродным  напылением,  окрашивались  2  %  уранилацетатом  и  контрастировались  цитратом  свинца.  Далее  срезы  оценивались  при  помощи  просвечивающего  электронного  микроскопа  JEOL  JEM-2100. 

Для  оценки  цитотоксичности  кальций-фосфатных  бионов  клетки  EA.hy  926  в  6-луночных  планшетах  (2*10⁵  клеток  на  лунку)  экспонировались  100  мкл  кальций-фосфатных  бионов  (0,5  или  2  МкФ)  или  фосфатно-солевому  буферу  в  течение  24  ч.  Аннексин  V/7-аминоактиномицин  D-тест  для  определения  апоптоза/некроза  проводился  с  использованием  соответствующего  набора  компании  BioLegend  в  соответствии  с  инструкциями  производителя,  оценка  результатов  проводилась  проточной  цитометрией  (BD  FACSCalibur  Flow  Cytometry  System).  Анализ  данных  проточной  цитометрии  проводился  посредством  программы  FCAP  Array.  Все  измерения  проводились  в  дублях,  и  средние  значения  использовались  для  последующего  анализа.  Далее,  клетки  EA.hy  926  в  96-луночных  планшетах  (2*10⁴  клеток  на  лунку)  экспонировались  10  мкл  кальций-фосфатных  бионов  (0,5  или  2  МкФ)  или  фосфатно-солевому  буферу  в  течение  24  ч.  MTT  (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия  бромид)-тест  для  оценки  клеточной  жизнеспособности  и  пролиферации  проводился  при  помощи  соответствующего  набора  компании  Life  Technologies  в  соответствии  с  инструкциями  производителя,  измерение  результата  проводилось  на  длине  волны  570  нм. 

Для  оценки  влияния  кальций-фосфатных  бионов  на  цитокиновый  профиль  клетки  EA.hy  926  в  6-луночных  планшетах  (2*10⁵  клеток  на  лунку)  экспонировались  100  мкл  кальций-фосфатных  бионов  (0,5  или  2  МкФ)  или  фосфатно-солевому  буферу  в  течение  24  ч.  Уровень  цитокинов  в  надосадке  с  клеточных  культур  измерялся  методом  иммуноферментного  анализа  посредством  соответствующих  наборов  компании  eBioscience  в  соответствии  с  инструкциями  производителя.  Все  измерения  проводились  в  дублях,  и  средние  значения  использовались  для  последующего  анализа.  Измерение  результата  проводилось  на  длине  волны  450  нм. 

Для  экспериментов  на  животных  были  использованы  четырнадцать  крыс-самцов  породы  Wistar  (вес  250–300  г,  возраст  12–14  недель).  Животные  содержались  в  полипропиленовых  клетках  (пять  крыс  на  клетку),  выстланных  деревом,  и  имели  доступ  к  воде  и  пище  ad  libitum.  В  течение  всего  времени  эксперимента  поддерживались  стандартные  условия  температуры  (24±1°C),  относительной  влажности  (55±10  %)  и  12-часовые  циклы  света  и  темноты.  Осмотр  крыс  проводился  ежедневно.  Все  процедуры  осуществлялись  в  соответствии  с  Европейской  конвенцией  о  защите  позвоночных  животных  и  были  одобрены  этическим  комитетом  ФГБНУ  «Научно-исследовательский  институт  комплексных  проблем  сердечно-сосудистых  заболеваний». 

После  введения  в  анестезию  3  %  изофлураном,  все  животные  получали  ингаляционную  анестезию  1,5  %  изофлураном  в  течение  всего  времени  операции.  Использовалась  оригинальная  экспериментальная  модель  ангиопластики  аорты  крысы  с  применением  баллона  для  коронарной  ангиопластики  [5,  с.  414].  Аорта  пунктировалась  в  проксимальном  направлении  иглой  21G,  баллонный  катетер  DIOR  2.0×15  мм  вставлялся  в  просвет  аорты  при  помочи  0.014-дюймового  проводника,  и  проводилась  ангиопластика  с  давлением  10  атмосфер  в  течение  10  секунд.  Катетер  выводился,  и  процедура  повторялась  трижды  для  повреждения  эндотелия.  Все  процедуры  проводились  в  асептических  условиях.  Раствор  кальций-фосфатных  бионов  (700  мкл,  0,5  МкФ)  или  такой  же  объем  0,9  %  NaCl  вводился  в  кровеносное  русло  опытных  и  контрольных  крыс  соответственно  (по  7  животных)  путем  инъекции  в  хвостовую  вену. 

Спустя  пять  недель  после  операции,  все  животные  умерщвлялись  передозировкой  углекислого  газа.  Сегменты  брюшной  аорты  крыс  (≥  2,5  см)  иссекались,  фиксировались  в  10  %  забуференном  формалине,  заключались  в  парафин,  и  производились  срезы  (3  мкм).  После  окраски  гематоксилин-эозином  и  по  ван  Гизону  в  соответствии  с  общепринятой  методикой,  срезы  с  каждой  аорты  оценивались  световой  микроскопией  (Axioscop  40  Lab  Microscope,  Carl  Zeiss)  для  оценки  гиперплазии  интимы  и  отношения  интимы  к  медии.  Ширина  интимы  и  медии  оценивалась  с  использованием  программы  ImageJ.  На  каждую  окраску  оценивалось  по  три  среза  с  каждой  крысы,  и  вычислялось  среднее  значение  для  статистического  анализа. 

Статистический  анализ  проводился  при  помощи  программы  MedCalc.  Оценка  нормальности  распределения  оценивалась  по  критерию  д’Агостино-Пирсона.  Данные  представлялись  с  помощью  медианы,  межквартильного  расстояния  (25  и  75  процентили),  среднего  и  доверительных  интервалов  (ДИ)  для  медианы  и  среднего.  В  зависимости  от  типа  распределения,  две  независимые  группы  сравнивались  по  U-критерию  Манна-Уитни  или  t-критерию  Стьюдента,  три  и  более  независимые  группы  сравнивались  по  критерию  Краскелла-Уоллиса  или  однофакторным  дисперсионным  анализом  (ОДА)  с  последующим  попарным  сравнением  по  U-критерию  Манна-Уитни  или  t-критерию  Стьюдента  в  том  случае,  если  статистически  значимые  различия  были  выявлены  критерием  Краскелла-Уоллиса  или  ОДА  соответственно.  Поправка  на  множественные  сравнения  проводилась  вычислением  средней  доли  ложных  отклонений  гипотез  (false  discovery  rate).  P-значения  или  q-значения  в  случае  вычисления  средней  доли  ложных  отклонений  гипотез  (q-значения  –  это  P-значения  после  поправки  с  использованием  этого  метода),  ≤  0,05  признавались  статистически  значимыми. 

Результаты  и  обсуждение

Посредством  просвечивающей  электронной  микроскопии  была  зафиксирована  интернализация  кальций-фосфатных  бионов  эндотелиальными  клетками  линии  EA.hy  926.  Затем  была  исследована  способность  кальций-фосфатных  бионов  вызывать  апоптоз  и  снижать  жизнеспособность  эндотелиальных  клеток.  Доля  клеток,  подвергшихся  позднему  апоптозу/некрозу,  была  статистически  значимо  выше,  в  то  время  как  доля  живых  клеток  была  статистически  значимо  ниже  в  культурах  эндотелиальных  клеток,  экспонированных  кальций-фосфатным  бионам  в  течение  24  часов,  в  сравнении  с  контрольными  культурами.  Кроме  того,  не  было  обнаружено  никакой  дозозависимой  связи  при  экспозиции  клеток  кальций-фосфатным  бионам  в  разных  концентрациях  (0,5  и  2  МкФ).  Уровень  интерлейкина-6  и  интерлейкина-8  был  статистически  значимо  выше  в  надосадке  с  культур  эндотелиальных  клеток,  экспонированных  кальций-фосфатным  бионам  в  течение  24  часов,  в  сравнении  с  контрольными  культурами. 

При  исследовании  эндотелиальной  токсичности  кальций-фосфатных  бионов  на  крысиной  модели  у  шести  из  семи  крыс,  экспонированных  кальций-фосфатным  бионам,  была  обнаружена  гиперплазия  интимы  брюшной  аорты.  Более  того,  у  трех  крыс  была  выявлена  значительная  концентрическая  или  эксцентрическая  гиперплазия  интимы,  чего  не  было  обнаружено  у  контрольных  крыс.  Отношение  интимы  к  медии  в  стенке  брюшной  аорты  также  было  статистически  значимо  выше  у  крыс,  экспонированных  кальций-фосфатным  бионам,  в  сравнении  с  контрольными  крысами. 

Таким  образом,  можно  сделать  вывод,  что  кальций-фосфатные  бионы  токсичны  для  эндотелиальных  клеток.  Кроме  того,  помимо  прямой  токсичности,  кальций-фосфатные  бионы  также  способствуют  выработке  интерлейкина-6  и  интерлейкина-8,  которые  известны  как  проатеросклеротические  цитокины  [1,  с.  356;  3,  с.  149].  Эндотелиальная  токсичность  кальций-фосфатных  бионов  определяет  их  патогенность,  поскольку  это  одно  из  главных  звеньев  в  развитии  атеросклероза  [7,  с.  16].  Полученные  результаты  не  противоречат  тому,  что  было  выявлено  в  предшествующих  работах  [4,  с.  2300;  6,  с.  e60904;  9,  с.  267;  10,  с.  616].  Можно  предположить,  что  кальций-фосфатные  бионы  являются  начальным  триггером  атеросклероза  и  могут  способствовать  развитию  местного  воспаления  путем  индукции  синтеза  проатеросклеротических  цитокинов. 

Список  литературы:

1. Apostolakis  S.,  Vogiatzi  K.,  Amanatidou  V.,  Spandidos  D.A.  Interleukin  8  and  cardiovascular  disease  //  Cardiovasc.  Res.  –  2009.  –  Vol.  84.  –  №  3.  –  P.  353–360.
2. Edgell  C.J.,  McDonald  C.C.,  Graham  J.B.  Permanent  cell  line  expressing  human  factor  VIII-related  antigen  established  by  hybridization  //  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  –  1983.  –  Vol.  80.  –  №  12.  –  P.  3734–3737.
3. Hartman  J.,  Frishman  W.H.  Inflammation  and  atherosclerosis:  a  review  of  the  role  of  interleukin-6  in  the  development  of  atherosclerosis  and  the  potential  for  targeted  drug  therapy  //  Cardiol.  Rev.  –  2014.  –  Vol.  22.  –  №  3.  –  P.  147–151.
4. Peng  H.H.,  Wu  C.Y.,  Young  D.,  Martel  J.,  Young  A.,  Ojcius  D.M.,  Lee  Y.H.,  Young  J.D.  Physicochemical  and  biological  properties  of  biomimetic  mineralo-protein  nanoparticles  formed  spontaneously  in  biological  fluids  //  Small.  –  2013.  Vol.  9.  –  №  13.  –  P.  2297–2307.
5. Sin'kov  M.A.,  Filip'ev  D.E.,  Sevost'yanova  V.V.,  Velikanova  E.A.,  Burago  A.S.,  Ganyukov  V.I.  Experimental  model  of  rat  aorta  angioplasty  with  a  Paclitaxel  releasing  balloon  catheter  //  Bull.  Exp.  Biol.  Med.  –  2014.  –  Vol.  156.  –  №  3.  –  P.  413–415.
6. Smith  E.R.,  Hanssen  E.,  McMahon  L.P.,  Holt  S.G.  Fetuin-A-containing  calciprotein  particles  reduce  mineral  stress  in  the  macrophage  //  PLoS  One.  –  2013.  –  Vol.  8.  –  №  4.  –  P.  e60904.
7. Tabas  I.,  García-Cardeña  G.,  Owens  G.K.  Recent  insights  into  the  cellular  biology  of  atherosclerosis  //  J.  Cell.  Biol.  –  2015.  –  Vol.  209.  –  №  1.  –  P.  13–22.
8. Wu  C.Y.,  Young  L.,  Young  D.,  Martel  J.,  Young  J.D.  Bions:  a  family  of  biomimetic  mineralo-organic  complexes  derived  from  biological  fluids  //  PLoS  One.  –  2013.  –  Vol.  8.  –  №  9.  –  P.  e75501.
9. Zhang  M.J.,  Liu  S.N.,  Xu  G.,  Guo  Y.N.,  Fu  J.N.,  Zhang  D.C.  Cytotoxicity  and  apoptosis  induced  by  nanobacteria  in  human  breast  cancer  cells  //  Int.  J.  Nanomedicine.  –  2014.  –  Vol.  9.  –  P.  265–271.
10. Zhang  M.,  Yang  J.,  Shu  J.,  Fu  C.,  Liu  S.,  Xu  G.,  Zhang  D.  Cytotoxicity  induced  by  nanobacteria  and  nanohydroxyapatites  in  human  choriocarcinoma  cells  //  Nanoscale.  Res.  Lett.  –  2014.  –  Vol.  9.  –  №  1.  –  P.  616.