РОЛЬ  ГЕНЕТИЧЕСКИХ  ПРЕДИКТОРОВ  В  ПРОГНОЗИРОВАНИИ  НЕВЫНАШИВАНИЯ  БЕРЕМЕННОСТИ  ПРИ  МНОГОПЛОДИИ

Никитина  Ирина  Николаевна

канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  акушерства  и  гинекологии,

Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

E-mail: 

Бойко  Владимир  Иванович

д-р  мед.  наук,  профессор,  зав.  кафедры  акушерства  и  гинекологии 
Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

Смииян  Светлана  Анатольевна

канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  акушерства  и  гинекологии,

Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

Иконописцева  Наталья  Анатольевна

канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  акушерства  и  гинекологии,

Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

Сухарев  Анатолий  Борисович

канд.  мед.  наук,  доцент  кафедры  акушерства  и  гинекологии,

Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

Бабар  Татьяна  Владимировна

канд.  мед.  наук,  ассистент  кафедры  акушерства  и  гинекологии,

Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

Калашник  Наталья  Владимировна

канд.  мед.  наук,  ассистент  кафедры  акушерства  и  гинекологии,

Сумской  государственный  университет, 
Украина,  г.  Сумы

ROLE  OF  GENETIC  PREDICTORS  IN  FORECASTING  DURING  MULTIPLE  PREGNANCY  MISCARRIAGE

Irina  Nikitina

candidate  of  Medical  Sciences,  assistant  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

Vladimir  Boykо

doctor  of  Medical  Sciences,  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

Svetlana  Smyian

candidate  of  Medical  Sciences,  assistant  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

Natalya  Ikonopisceva

candidate  of  Medical  Sciences,  assistant  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

Anatoliy  Sukharev

candidate  of  Medical  Sciences,  assistant  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

Tatyana  Babar

candidate  of  Medical  Sciences,  assistant  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

Natalya  Kalachnik

candidate  of  Medical  Sciences,  assistant  professor  of  department 
of  Obstetrics  and  Gynecology  Sumy  State  University, 
Ukraine,  Sumy

АННОТАЦИЯ

Изучены  особенности  распределения  полиморфизма  генов  IL-8  (-781  C/T),  MTHFR  С677T,  Fll  G20210А,  FV(Leiden)  G1691A  и  PAI-1675  5G/4G  и  их  роль  у  женщин  с  невынашиванием  многоплодной  беременности.  Проведена  оценка  прогностической  роли  выявленных  генетических  предикторов  в  развитии  невынашивания  беременности.  При  анализе  частоты  аллелей  и  генотипов  показан  риск  репродуктивных  потерь  между  обследованными  женщинами  и  контрольной  группой,  обнаружены  наиболее  значимые  генетические  маркеры  и  определено  взаимодействие  по  полиморфизмам  изученных  генов.

ABSTRACT

The  distribution  of  gene  polymorphisms  of  IL-8  (-781  C/T),  MTHFR  С677T,  Fll  G20210А,  FV(Leiden)  G1691A  and  PAI-1675  5G/4G  and  their  role  in  women  with  a  multiple  pregnancy  miscarriage.  The  prognostic  role  of  identified  genetic  predictors  in  the  development  of  miscarriage  is  evaluated.  The  risk  of  reproductive  losses  risk  comparing  the  control  group  by  different  genotypes  us  considered,  the  most  significant  genetic  markers  are  discovered  and  different  genes  polymorphism  interaction  is  discussed.

Ключевые  слова:  многоплодная  беременность;  невынашивание  беременности;  полиморфизм;  мутация  генов.

Keywords:  multiple  pregnancy;  miscarriage;  polymorphism;  genes  mutation  .

В  настоящее  время  вопросы  невынашивания  беременности  (НБ)  приобрели  статус  одного  из  приоритетных  направлений  в  акушерстве  в  связи  с  распространенной  высокой  частотой  неблагоприятных  исходов  для  матери  и  плода.  Особенно  остро  эта  проблема  касается  многоплодной  беременности  [1,  с.  15–21].  Это  обусловлено  ростом  ее  числа  за  счет  широкого  внедрения  в  практику  здравоохранения  эффективных  методик  лечения  бесплодия.  Частота  преждевременных  родов  при  многоплодии  составляет  54,3  %  по  сравнению  с  9,7  %  при  одноплодной  беременности.  Невынашивание  беременности  можно  рассматривать  как  мультифакторное  заболевание,  возникающее  в  результате  взаимодействия  функционально  слабых  аллелей  многих  генов  на  фоне  неблагоприятных  внешних  и  внутренних  факторов  влияния  на  организм  женщины.  Поиск  генетических  маркеров  мультифакторной  патологии,  основанный  на  изучении  полиморфизма  отдельных  генов,  является  очень  важным,  а  определение  аллелей  генов,  которые  определенным  образом  влияют  на  течение  беременности,  имеет  огромное  значение  для  выявления  групп  риска  и  предупреждения  возникновения  невынашивания  беременности  [3,  с.  69–77]. 

Доля  наследственных  тромбофилий  в  структуре  причин  НБ  составляет  30–55  %.  Основными  считаются  полиморфизм  генов  ферментов  фолатного  цикла  (5,  10-метилентетрагидрофолат  редуктаза  MTHFR  С677T);  свертывающей  системы  крови  (мутация  генов  протромбина  Fll  G20210А,  фактора  V  FV(Leiden)  G1691A)  системы  фибринолиза  (полиморфизм  гена  ингибитора  активатора  плазминогена  1  PAI-1675  5G/4G)  [4,  с.  937–942]. 

MTHFR  –  фермент  группы  флавопротеинов,  играет  важную  роль  в  синтезе  метионина  из  гомоцистеина.  Носительство  аллеля  677Т  приводит  к  термолабильности  фермента  и  замене  в  молекуле  фермента  аминокислоты  аланина  на  валин  (Ala222Val)  в  каталитическом  домене,  в  результате  отмечается  снижение  ферментативной  активности  у  гомозигот  по  полиморфному  аллелю  на  60  %,  а  у  гетерозигот  на  30  %,  что  влечет  за  собой  повышение  уровня  гомоцистеина.  Патогенез  осложнений  при  гомоцистеинемии  заключаются  в  повреждении  эндотелия  сосудов  с  повышением  процессов  коагуляции,  микротромбообразование,  приводящее  к  нарушению  инвазии  трофобласта,  плацентации  и  фетоплацентарного  кровотока.  Кроме  того  гомоцистеин  переходит  через  плаценту  и  может  вызвать  тератогенное  и  фетотоксическое  действие  [6,  с.  105–137]. 

Основным  механизмом,  предотвращающим  тромбообразование,  является  фибринолиз,  его  центральное  звено  –  ингибитор  активатора  плазминогена  1  (РАI-1),  уровень  которого  в  плазме  зависит  от  полиморфизма  гуанозина  (5G/4G)  делеция/вставка  в  области  промотера  гена  РАI-1.  Угнетение  фибринолиза,  вызванное  полиморфизмом  этих  генов  в  основном  в  гомозиготном  состоянии  нарушает  процесс  имплантации  бластоцисты  и  формирование  системы  «мать-плацента-плод»,  что  может  стать  как  причиной  бесплодия  и  ранних  потерь  беременности,  так  и  привести  к  аномалиям  плацентации  и  спровоцировать  развитие  патогенетических  механизмов  акушерских  осложнений:  невынашивание  беременности,  антенатальная  гибель  плода  [4,  с.  937–942]. 

К  ряду  осложнений  беременности,  а  именно:  невынашиванию,  фетоплацентарной  дисфункции,  гестозу,  задержке  развития  плода  ведет  наличие  мутации  FV(Leiden).  В  результате  мутации  G1691A  происходит  замена  остатка  аргинина  на  глицин  в  участке  506,  что  приводит  к  нечувствительности  фактора  V  к  активированному  белку  С,  повышается  уровень  этого  фактора  в  плазме,  что  ведет  к  усиленному  образованию  тромбина  и  патологии  свертывания  крови,  которая  является  причиной  осложнений  гестации.  Мутация  гена  протромбина  Fll  G20210А  характеризуется  заменой  гуанина  на  аденин  в  позиции  20210,  при  этом  полиморфизме  уровень  протромбина  в  плазме  может  быть  повышен  на  30  %,  что  провоцирует  появление  избыточного  количества  сгустков,  повышая  риск  венозных  тромбозов  и  приводит  к  потерям  плода  преимущественно  в  I  триместре.  Мутация  имеет  аутосомно-доминантный  тип  наследования,  что  свидетельствует  о  том,  что  тромбофилия  может  возникнуть  и  у  гетерозиготного  носителя.  Гетерозиготное  носительство  ассоциируется  с  нарушением  плацентации  и  риском  НБ  в  ранние  сроки.

Существуют  данные  о  влиянии  полиморфизма  генов  цитокинов  на  создание  имунного  ответа  и  течение  беременности.  IL-8,  который  продуцируют  клетки  плаценты,  потенцирует  иммунную  компетентность  плацентарных  клеток  против  бактерий,  атакующих  фетоплацентарный  комплекс  [5,  с.  406–414].  IL-8  активно  участвует  в  развитии  трофобласта  на  ранних  сроках  беременности.  Одним  из  ответственных  факторов  за  процесс  успешной  инвазии  трофобласта  является  именно  IL-8.  Этот  цитокин  влияет  на  индукцию  ангиогенеза  в  месте  прикрепления  зародыша.  Повышение  секреции  IL-8  в  системе  «мать-плацента-плод»  свидетельствует  о  его  важной  роли  в  поддержании  иммунологической  толерантности  во  время  беременности  [2,  с.  45–49]. 

Целью  нашего  исследования  было  снижение  частоты  невынашивания  беременности  путем  изучения  и  прогнозирования  влияния  генетических  предикторов  у  женщин  с  многоплодием.

Материалы  и  методы.  Работа  выполнена  на  базе  Сумского  обласного  перинатального  центра,  лаборатории  молекулярно-генетических  исследований  Сумского  государственного  университета.  Обследовано  160  пациенток  с  двойней,  у  84  (52,5  %)  из  которых  беременность  протекала  на  фоне  угрозы  самопроизвольного  выкидыша  или  преждевременных  родов,  они  составили  основную  группу  обследованных  женщин.  Контрольная  группа  состояла  из  47  беременных  с  физиологическим  течением  гестации.  Все  пациентки  проходили  молекулярно-генетическое  тестирование  мутации  генов  IL-8  (-781  C/T),  MTHFR  С677T,  Fll  G20210А,  FV(Leiden)  G1691A  и  PAI-1  675  5G/4G. 

Для  определения  связи  полиморфизма  с  невынашиванием  беременности  было  проведено  выделение  ДНК  из  периферической  крови  беременных,  для  этого  венозную  кровь  набирали  в  моноветы  объемом  2,7  мл  с  антикоагулянтом  (“Sarstedt”,  Германия).  ДНК  выделяли  из  лейкоцитов  цельной  крови  с  использованием  наборов  DIAtomDNAPrep  100  (“Isogene”,  Россия).  Определение  аллельного  полиморфизма  проводилось  с  использованием  аллель-специфической  полимеразной  цепной  реакции  (ПЦР)  с  последующим  гидролизом  ампликонов  соответствующей  рестриктирующей  эндонуклеазой.  Геномную  ДНК  из  образцов  крови  выделяли  по  стандартной  методике  с  использованием  протеиназы  К,  фенол-хлороформной  экстракции  и  осаждения  этанолом.  Идентификацию  аллельных  вариантов  проводили  по  наличию  узнавания  для  соответствующей  реструктирующей  эндонуклеазы  с  помощью  электрофореза.  При  наличии  мутации  обнаруживали  образование  двух  низкомолекулярных  полос,  появляющихся  под  действием  фермента.  Полное  расщепление  продукта  ПЦР  свидетельствовало  о  наличии  в  анализируемой  ДНК  гомозиготной  формы  мутации,  а  частичное  –  гетерозиготной.  Анализ  распределения  изучаемых  генотипов  проводился  с  помощью  теста  χ².  Распределение  генотипов  по  исследуемым  полиморфными  локусам  проверено  на  соответствие  равновесии  Харди-Вайнберга  с  помощью  теста  Фишера.  Для  сравнения  частот  аллелей  между  разными  группами  использовали  критерий  Пирсона.  Различия  считались  статистически  значимыми  при  р<0,05.  Для  анализа  ассоциации  аллелей  и  генотипов  исследуемых  генов  с  риском  развития  акушерских  осложнений  рассчитано  отношение  шансов  (OR)  с  95  %  доверительными  интервалами. 

Результаты  и  обсуждение.  Результаты  проведенного  молекулярно-генетического  тестирования  показали,  что  мутация  MTHFR  С677T  обнаружена  у  32  женщин  (38,1  %),  полиморфизм  гена  PAI-1  675  5G/4G  у  16  (19,0  %),  Fll  G20210А  у  1  (1,2  %),  FV(Leiden)  G1691A  у  7  (8,3  %)  и  различные  комбинации  мутаций  у  28  (33,3  %).  Для  выявления  возможных  ассоциаций  полиморфизмов  генов  с  НБ  нами  был  проведен  сравнительный  анализ  частот  аллелей  и  генотипов  между  пациентками  с  невынашиванием  беременности  и  контрольной  группой.  Согласно  полученным  результатам  полиморфизм  MTHFR  С677T  у  женщин  основной  группы  встречался  в  гетерозиготном  варианте  у  (51,2  %),  в  контрольной  группе  (13,5  %),  гомозиготная  мутация  гена  MTHFR  С677T  составила  (15,4  %),  что  в  три  раза  превысило  показатели  контрольной  группы  (5,4  %).  Анализ  мутации  гена  PAI-1  675  5G/4G  в  основной  группе  показал  снижение  нормального  генотипа  5G/4G  (54,8  %)  по  сравнению  с  контрольной  группой  (75,7  %,  р<0,05),  при  этом  доля  гетеро-  и  гомозиготных  носителей  генотипов  была  выше  по  сравнению  с  контрольной  группой  (25,0  %  и  20,2  %,  против  18,9  %  и  5,4  %).  Отмечена  высокая  частота  гомо-  и  гетерозиготного  носительства  мутации  FV(Leiden)  G1691A  (12,8  %,  2,6  %)  по  сравнению  с  контрольной  группой  (2,7  %,  0  %).

При  проведении  исследования  распределения  полиморфизма  гена  IL-8  в  локусе  –  781С/Т  получены  результаты  в  виде  фрагментов  аллельных  генов.  Для  полиморфизма  гена  781С/Т  IL-8  гомозигота  по  доминантному  типу  была  обозначена  как  –  СС,  гетерозигота  –  СТ,  гомозигота  по  рецессивному  типу  –  TT.  У  женщин  с  невынашиванием  беременности  получены  следующие  результаты:  CC  –  (19,1  %)  случаев,  CТ  –  (57,1  %)  случаев,  ТТ  –  (23,8  %)  случаев.  В  контрольной  группе  соответствующие  показатели  составили  (42,5  %)  (40,4  %)  и  (17,1  %). 

Генетическим  маркером  успешного  течения  беременности  является  наличие  аллеля  С  в  локусе  –  781  С/Т  гена,  кодирующего  IL-8.  Носители  Т-аллеля  имеют  в  1,85  раза  выше  риск  развития  осложнений  беременности.  Гомозигота  по  аллели  ТТ  (-781  С/Т)  имеет  достоверно  меньшие  шансы  на  успешное  течение  беременности,  чем  суммарно  все  носители  доминантного  гена,  а  именно  в  1,5  раза.  Все  носители  рецессивного  аллельного  гена  достоверно  имеют  втрое  выше  риск  развития  патологии  беременности  по  сравнению  с  гомозиготой  по  доминантному  аллели.  Носители  генотипа  С/T  и  T/T  имеют  относительные  риски  в  2  и  1,5  раза  выше  по  сравнению  с  носителями  гомозиготного  по  доминантной  аллели  гена  по  развитию  невынашивания  беременности. 

Выводы.  В  результате  проведенного  исследования  удалось  определить  наиболее  важные  предикторы,  ассоциирующиеся  с  риском  невынашивания  беременности  при  многоплодии  MTHFR  С677T,  FV(Leiden)  G1691A  и  IL-8  (-781  C/T).  Комбинации  как  гомо-,  так  и  гетерозиготных  генотипов  этих  генов  ассоциируются  с  риском  развития  репродуктивных  потерь. 

Своевременное  выявление  генетических  предикторов  позволит  оптимизировать  преконцепционную  подготовку  для  снижения  риска  репродуктивных  потерь  и  акушерских  осложнений.  Наличие  генетических  маркеров  послужит  показанием  к  усиленному  контролю  гемостаза,  иммунологического  статуса,  уровня  гомоцистеина  во  время  беременности  и  при  необходимости  проведение  лечебных  мероприятий.

Список  литературы:

1. Дубоссарская  З.М.  Основные  вопросы  иммунологии  репродукции  /  З.М.  Дубоссарская,  Ю.А.  Дубоссарская  //  Здоровье  Украины.  –  2010.  –  №  4  (31).  –  С.  15–21.
2. Охтырская  Т.А.  Роль  RAI-1  в  повторных  неудачах  ВРТ  /  Т.А.  Охтырская,  К.А.  Яворовская,  Н.М.  Файзуллина,  Л.С.  Ежова,  Т.А.  Демура,  А.В.  Шуршалина  //  Проблемы  репродукции.  –  №  4.  –  С.  45–49.
3. Associations  between  cytokine  gene  polymorphisms  and  recurrent  pregnancy  loss  /  S.  Daher,  N.  Shulzhenko,  A.  Morgun  [et  al.]  //  J.  of  Reproductive  Immunology.  –  2003.  –  Vol.  58,  –  №  1.  –  P.  69–77.
4. Bura-Riviere  A.  Trombophilia  and  pregnancy.  Rev.  Prat.  –  Vol.  62,  –  №  7.  –  P.  937–942. 
5. Medica  I.  Association  between  genetic  polymorphisms  in  cytokine  genes  and  recurrent  miscarriage  –  a  meta-analysis  /  I.  Medica  //  Reproductive  BioMedicine.  –  2009.  –  Vol.  19,  –  №  3.  –  Р.  406–414. 
6. Murphy  M.M.,  Fernandes-Ballart  J.D.  Homocystein  in  pregnancy.  Adv.  Clin.  Chem.  –  Vol.  53.  –  P.  105–137.