ИССЛЕДОВАНИЕ  ЭНДО-ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ  АКТИВНОСТИ  РАЗНЫХ  ВИДОВ  ДРОЖЖЕЙ

Шаламитский  Максим  Юрьевич

аспирант,  Национальный  институт  винограда  и  вина  «Магарач»,  РФ,  г.  Ялта

E-mail: 

STUDYING  ENDO-POLYGALACTURONASE  ACTIVITY  OF  VARIOUS  YEASTS  SPECIES

Shalamitskiy  Maksym

post-graduate  student,  National  Institute  for  Vine  and  Wine  "Magarach",  Russia,  Yalta

АННОТАЦИЯ

Изучено  продуцирование  полигалактуроназ  различными  видами  дрожжей,  находящимися  на  хранении  в  Национальной  коллекции  микроорганизмов  для  виноделия  НИВиВ  «Магарач».  Наибольшую  активность  фермента  показали  дрожжи  Kluyveromyces  marxianus.  Полученные  данные  согласуются  с  данными  полученными  другими  исследователями  по  некоторым  штаммам  дрожжей.  Изучение  влияния  условий  хранения  на  способность  синтезировать  данные  ферменты  требует  дальнейшего  изучения,  т.  к.  некоторые  штаммы,  исследованные  ранее  другими  учёными,  не  показали  ферментативной  активности.

ABSTRACT

Polygalacturonase  production  by  various  yeast  species  had  been  studied.  The  highest  activity  of  the  enzyme  showed  yeast  strain  Kluyveromyces  marxianus.  Obtained  data  for  some  strains  agree  with  the  data  received  by  other  researchers.  Studying  of  the  influence  of  storage  conditions  on  the  ability  to  produce  this  enzyme  requires  further  study,  because  some  strains  investigated  previously  by  other  scientists  showed  no  enzymatic  activity.

Ключевые  слова :  полигалактуроназа;  дрожжи;  вино.

Keywords :  polygalacturonase;  yeasts;  wine.

В  настоящее  время  наблюдается  тенденция  к  увеличению  посадок  комплексноустойчивых  сортов  винограда  на  территории  стран  Центральной  и  Восточной  Европы.  Так,  за  последние  десятилетия,  площади  занимаемые  данными  сортами  винограда  составили  более  10  тыс.  га  [11].  Комплексноустойчивые  сорта  винограда  характеризуются  способностью  противостоять  заболеваниям,  вредителям  и  отрицательным  воздействиям  природных  факторов. 

Одной  из  причин,  способствующей  устойчивости  сорта  к  низким  температурам,  является  высокое  содержание  в  винограде  коллоидных  веществ,  среди  которых  важное  место  занимают  пектиновые  вещества.  В  то  же  время,  по  данным  литературы,  высокое  содержание  биополимеров  отрицательно  влияет  на  процесс  осветления  сусла  при  переработке  винограда.

По  данным  различных  исследователей,  содержание  пектиновых  веществ  в  винограде  колеблется  в  пределах  0,30—1,31  %.  Так,  исследованиями  Бареевой  и  Донченко  показано,  что  содержание  пектина  в  таких  комплексно-устойчивых  сортах,  как  Цитронный  Магарача,  Первенец  Магарача,  Виорика,  колеблется  в  от  1,85  %  до  2,03  %  [2].  В  то  же  время,  исследования  С.С.  Тюриной  показали,  что  для  успешного  прохождения  процесса  осветления  сусла,  за  счёт  собственных  ферментов  виноградной  ягоды,  содержание  суммы  биополимеров  не  должно  превышать  0,12  %,  в  т.  ч.  пектина  не  более  0,03  %  [12]. 

Таким  образом,  при  переработке  сортов  с  повышенным  содержанием  пектиновых  веществ  одним  из  приёмов  снижения  их  количества  является  применение  ферментов.  Так  в  практике  современного  виноделия  для  этой  цели  используют  различные  ферментные  препараты  пектолитического  действия,  такие  как  Пектофоетидин,  Пектаваморин,  Rapidase,  Lallzyme  и  др.

В  настоящее  время  имеется  ряд  исследований  по  изучению  внеклеточных  ферментов,  вырабатываемых  винными  дрожжами,  которые  выделяют  в  культуральную  среду  гидролитические  ферменты:  эндо-полигалактуроназу,  пектинэстеразу,  протеиназу,  гемицеллюлазы  и  др.  [1].  Эндо-полигалактуроназа  дрожжей  способствует  расщеплению  α-1,4-D-галактозидуронидных  связей,  что  влияет  на  снижение  вязкости  сусла  за  счёт  разрушения  полимерной  сетки,  удерживающей  во  взвешенном  состоянии  частицы  мути.  Благодаря  этому  происходит  более  быстрое  и  полное  осветление  [4;  9].

Как  показывают  исследования  отечественных  и  зарубежных  исследователей  эндо-полигалактуроназная  активность  отмечается  у  разных  видов  дрожжей.  Так,  Энкер  наблюдал  действие  пектолитических  ферментов  у  дрожжей  Saccharomyces  vini  [13],  Мосиашвили  и  Патарая  отмечали  эндо-полигалактуроназную  и  пектинэстеразную  активность  у  дрожжей  Saccharomyces  paradoxus  и  Saccharomyces  oviformis  [7],  Мунгиевой  была  обнаружена  ферментативная  активность  в  культуральной  жидкости  дрожжей  Sacch.  Uvarum  [8],  Датунашвили  было  обнаружено  наличие  пектолитических  ферментов  у  вида  Kluyveromyces  marxianus  [5]. 

Цель  исследования:   изучение  эндо-полигалактуроназной  активности  штаммов  дрожжей  из  Национальной  коллекции  микроорганизмов  для  виноделия  (НКМВ)  НИВиВ  «Магарач».

Объекты  исследования   —  штаммы  дрожжей  из  НКВМ  НИВиВ  «Магарач». 

Методика  исследования.

I)    Способность  к  синтезу  эндо-полигалактуроназы  исследуемыми  штаммами  изучали  с  помощью  «тарелочного»  теста  [14;  15]:  штаммы  дрожжей  рассевали  на  чашки  Петри  с  агаризованной  средой  YBN  без  аминокислот,  содержащей  0,5  %  глюкозы  и  0,5  %  полигалктуроновой  кислоты.  Инкубирование  проводили  в  термостате  при  t  =  (30  ±  0,5)°С.  Двухсуточные  колонии  обрабатывали  6М  раствором  соляной  кислоты.  Наличие  зон  просветления  вокруг  колоний  свидетельствовало  о  наличии  эндо-полигалактуроназной  активности  у  исследуемых  штаммов.

II)   Эндо-полигалактуроназную  активность  дрожжей  определяли:  штаммы  культивировали  на  виноградном  сусле,  разбавленном  дистиллированной  водой  до  содержания  массовой  концентрации  сахаров  90—100  г/дм³.  После  инокуляции  штаммы  культивировали  в  термостате  при  t  =  (26  ±  0,5)  °С  в  течение  7  дней.  Дрожжевой  осадок  удаляли  путем  центрифугирования.  Эндо-полигалактуроназную  активность  определяли  в  надосадочной  (культуральной)  жидкости  проводили  вискозиметрическим  методом  Лифшиц  Д.Б.  [6]  в  модификации  Тюриной  С.С.  [12].  Данный  метод  основан  на  измерении  снижения  вязкости  раствора  пектина  в  процессе  его  гидролиза  ферментами.

В  качестве  субстрата  использовали  0,8  %-ный  раствор  цитрусового  пектина  (Sigma)  в  ацетатном  буфере  (рН  5.1).

За  единицу  активности  принимали  такое  количество  фермента,  которое  гидролизует  1  мг  пектина  в  минуту  при  температуре  30  °С  и  рН  5.0  со  снижением  вязкости  раствора  субстрата  на  20  %.

Расчет  проводили  по  формуле:

  (1)

где:  64  —  количество  субстрата  в  реакционной  среде,  мг;

Т_20%  —  время,  в  течение  которого  вязкость  субстрата  снижается  на  20  %,  мин;

V  —  количество  фермента,  внесенного  в  реакционную  среду,  см³.

    Результаты  исследования

Первоначальный  анализ  имеющихся  данных  о  коллекционных  культурах  НКВМ  показал,  что  в  коллекции  хранятся  более  пятидесяти  культур  дрожжей,  способных  синтезировать  эндо-полигалактуроназу.  Для  исследований  отобрали  66  штаммов  дрожжей  следующих  видов:  Saccharomyces  vini  —  12,  Saccharomyces  paradoxus  —  6,  Saccharomyces  uvarum  —  9,  Saccharomyces  oviformis  —  1,  Zygosaccharomyces  sp  —  7,  Zygosaccharomyces  bailii  —  5,  Kluyveromyces  marxianus  —  20,  Kluyveromyces  sp.  —  6. 

«Тарелочный»  тест  позволил  исключить  из  общего  числа  исследуемых  культур  32  штамма  дрожжей,  которые  не  синтезировали  данный  фермент.

В  табл.  1  представлены  результаты  вискозиметрического  анализа  34  штаммов  дрожжей  по  их  способности  синтезировать  эндо-полигалактуроназу:  S.  vini  —  6,  S.  paradoxus  —  6,  S.  uvarum  —  6,  S.  oviformis  —  1,  Kluyveromyces  marxianus  —  15.

Таблица   1.

Активность  фермента  эндо-полигалактуроназы

Анализ  полученных  результатов  показал,  что  наивысшей  активностью  фермента  обладают  штаммы  рода  Kluyveromyces  marxianus.  Ферментативная  активность  варьировалась  в  пределах  от  278  единиц  у  штамма  III-73,  до  1673  у  штамма  III-74.  Ферментативная  активность  эндо-полигалактуроназы  у  дрожжей  сахаромицетов  была  на  порядки  ниже  и  варьировалась  в  пределах  0,58  до  6,4,  за  исключением  двух  штаммов,  которые  показали  высокую  активность  в  64  и  128  единиц.

Так  дрожжи  Kluyveromyces  обладают  на  порядок  большей  активностью,  чем  дрожжи  сахаромицеты.

Проведенное  исследование  показало,  что  культуры  I-421  (Ужгород  231-1)  и  I-438  (Берегово  2-10),  штамм  III-360  (штамм  ВКМ  У-848)  при  длительном  хранении  в  музее  сохранили  свою  эндо-полигалактуроназную  активность,  т.  к.  полученные  нами  данные  совпадают  с  ранее  опубликованными  [3;  10],  в  то  же  время  имеются  штаммы,  у  которых  данная  активность  пропала. 

В  результате  проведенного  исследования  нами  были  отобраны  штаммы  дрожжей  Kluyveromyces  (III-74,  III-76,  III-360)  с  целью  изучения  их  влияния  на  снижения  содержания  пектина  в  сусле  на  стадии  настаивания  и  осветления  сусла. 

Список  литературы:

1.Абдуразакова  С.Х.  Изучение  внеклеточных  ферментов  винных  дрожжей  и  пути  индуцированного  их  образования  при  спиртовом  брожении  /  С.Х.  Абдурозакова,  Х.Т.  Саломов,  Т.М.  Фомичева  //  Вопросы  биохимии  винограда  и  вина.  1975.  М.:  Пищевая  промышленность  —  с.  266—269.

2.Бареева  Н.Н.,  Донченко  Л.В.  Оценка  сортов  винограда  нового  поколения  как  сырья  для  комплексной  переработки/  Научный  журнал  КубГАУ.  —  2006.  —  №  18  (02)  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://ej.kubagro.ru/2006/02/pdf/11.pdf

3.Бутова  С.Н.  Разработка  биотехнологических  основ  деградации  отходов  растительного  сырья  ферментами  пектолитического  комплекса:  Автореф.  дис.  …  д-ра  биол.  наук.  М.:  МГУПП,  2005.  —  11—12  с.

4.Датунашвили  Е.Н.  Ферменты  виноградной  ягоды,  гидролизующие  высокомолекулярные  углеводы  /  Е.Н.  Датунашвили,  С.С.  Тюрина,  Ф.М.  Бутова  //  Физиология  растений.  —  1977.  —  т.  24.  —  вып.  2.  —  с.  285—290.

5.Датунашвили  Е.Н.,  Астапович  Н.И.,  Лебедев  В.В.  Изучение  условий  биосинтеза  полигалактуроназы  дрожжами  Fabospora  fragilis  /Е.Н.  Датунашвили,  Н.И.  Астапович,  В.В.  Лебедев  //  Депонированная  рукопись  представлена  в  ВНИИВиВ  «Магарач».  1980,  Ялта.  —  17  с. 

6.Лифшиц  Д.Б.  Унифицирование  методов  определения  активности  ферментных  препаратов  производственного  назначения  /  Д.Б.  Лифшиц.  Киев:  Украинский  НИИНТИ  и  ТЭИ,  1967.  —  с.  33—52,  83—90.

7.Мосиашвили  Г.И.,  Исследование  дрожжей  вида  Saccharomyces  paradoxus  /  Г.И.  Мосиашвили,  М.С.  Патарая  //  Виноделие  и  виноградарство  СССР.  —  1969.  —  №  6.  —  с.  18—19.

8.Мунгиева  Н.А.  Получение  чистой  дрожжевой  полигалактуроназы  и  изучение  условий  её  применения  в  виноделии:  Дис.  …  канд.  техн.  наук.  Ялта:  ИВиВ  «Магарач»,  1980.  —  24—25  с.

9.Сапожникова  Е.В.  Пектиновые  вещества  и  пектолитические  ферменты  /  Е.В.  Сапожникова  М.:  Москва,  1971.  —  45  с.

10.Сонина  Е.Г  Совершенствование  технологии  производства  виноградного  сока  и  виноматериалов  на  основе  использования  пектолитических  ферментов  дрожжей:  Дисс…  канд.  техн.  наук.  Ялта:  ИВиВ  «Магарач»,  1990.  —  47—51  с.

11.Трошин  Л.П.  Ампелографическая  и  селекционная  научно-исследовательская  работа  Кубанского  госагроуниверситета/  Научный  журнал  КубГАУ.  —  2012.  —  №  81  (7)  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://ej.kubagro.ru/2012/07/pdf/39.pdf

12.Тюрина  С.С.  Исследование  пектолитических  ферментов  виноградной  ягоды:  Автореф.  дис...  канд.  биол.  наук.  М.,  1977.  —  17  с.

13.Энкер  П.Б.  Ферментативное  разрушение  пектиновых  веществ  ягод  с  участием  винных  дрожжей:  Автореферат  дис.  …  канд.  биол.  наук.  Алма-Ата:  АН  КазССР,  1968.  —  16  с.

14.Production  and  partial  characterization  of  an  endopolygalacturonase  from  Saccharomyces  cerevisiae  /  Blanco  P.  [et  al.]  //  Canadian  Journal  of  Microbiology.  —  1994.  —  №  40.  —  p.  974—977.

15.Schwan  R.F.,  Cooper  R.M.,  Wheals  A.E.  Endo-polygalacturonase  secretion  by  Kluyveromyces  marxianus  and  other  cocoa  pulp-degrading  yeasts  /  R.F.  Schwan,  R.M.  Cooper,  A.E.  Wheals  //  Enzyme  and  Microbial  Technology.  —  1997.  —  №  21.  —  p.  234—244.