ГЕНОТИПИРОВАНИЕ  DROSOPHILA  MELANOGASTER

Мелащенко  Елена  Сергеевна

лаборант  лаборатории  молекулярно-генетических  технологий  инновационного  парка  БФУ  им.  И.  Канта,  студентка  Балтийского  Федерального  Университета  им.  И.  Канта,  РФ,  г.  Калининград

E-mail: 

GENOTYPING  OF  DROSOPHILA  MELANOGASTER

Melashchenko  Elena

lab  technician  laboratory  of  molecular-  genetic  technologies  innovation  park  BFU,  student  of  Baltic  Federal  University,  Russia,  Kaliningrad

АННОТАЦИЯ

Целью  работы  являлось  генотипирование  Drosophila  melanogaster  основанное  на  различии  генотипов  ее  бактерии  Wolbachia.  Для  достижения  цели  использовались  методы:  выделение  ДНК,  ПЦР  и  электрофорез.  Был  определен  генотип  Wolbachia,  а  так  же  выявлена  видовая  принадлежность  дрозофил.

ABSTRACT

The  main  work  objective  was  Drosophila  melanogaster  genotyping  based  on  the  distinction  between  genotypes  of  its  bacterium  Wolbachia.  With  that  end  in  view,  such  methods  were  used:  DNA  extraction,  PCR  and  electrophoresis.  The  genotype  of  Wolbachia  was  defined  as  well  as  species  of  drosophilas  was  identified.

Ключевые  слова:  генотип;  Drosophila  melanogaster;  Wolbachia;  выделение  ДНК;  ПЦР;  электрофорез.

Keywords:  genotype;  Drosophila  melanogaster;  Wolbachia;  DNA  extraction;  PCR;  electrophoresis.

Плодовая  мушка  Drosophila  melanogaster  —  насекомое  семейства  Drosophiliadae  из  отряда  Diptera.  Популярный  модельный  объект  биологии,  в  частности  генетики  и  биологии  развития.  Это  связано  с  простотой  и  удобством  культивирования  в  лабораторных  условиях,  коротким  жизненным  циклом,  возможностью  получения  большого  количества  потомства  от  одного  скрещивания.

В  популяциях  Drosophila  melanogaster  широко  распространена  бактерия  Wolbachia  [1,  с.  404].  Особенности  этого  эндопаразита  заключаются  в  таких  малоизученных  симбиотических  проявлениях,  как  увеличение  плодовитости,  выживаемости  и  даже  адаптивности.  Она  размножается  в  женских  половых  путях  и  передается  по  материнской  линии,  что  объясняет  меньшую  важность  самцов  при  ее  распространении  [7,  с.  587].  И  с  этого  момента  начинаются  паразитические  проявления  Wolbachia:  феминизация,  партеногенез,  цитоплазматическая  несовместимость  и  андроцид  [3,  с.  1].

Для  содержания  линий  Drosophila  melanogaster  в  лабораторных  условиях  использовалась  среда  на  основе  спрессованных  дрожжей. 

Таблица  1.

Протокол  варки  среды

После  варки,  чтобы  предохранить  от  прорастания  плесени,  в  среду  добавлялся  нипангин  растворенный  в  96  %-ном  спирте  из  расчета  10  мл  раствора  на  1  л  среды,  что  в  конечном  пересчете  на  сухой  нипангин  составляет  0,1  %  [2,  с.  46].  Далее  среда  произвольно  разливалась  по  пробиркам  (использовались  фалконы  на  50  мл)  и  закрывалась  ватной  пробкой.  Вата  должна  быть  в  пробирке  почти  всегда,  за  исключением  момента  перевода  культуры  на  новый  субстрат,  это  делается  для  избегания  заползания  в  пробирку  мух  другой  линии  или  дикого  типа  [2,  с.  50].

Объектом  выделения  нуклеиновой  кислоты  был  организм  самки  дрозофилы.  Выполнялась  поставленная  задача  двумя  методами,  базирующимися  на  осаждении  ДНК  при  центрифугировании: 

1.  «Колоночный»  метод.  Использование  набора  колонок  с  силикой  (SiO₂).

2.  Выделение  ДНК  с  помощью  Proteinase  K  и  деинсталлирующего  буфера  (DB). 

Контролем  выхода  нуклеиновой  кислоты,  после  экстракции  было  измерение  концентрации  ДНК  с  помощью  электрофотометра.

Для  получения  достаточного  количества  детектируемого  материла  проведено  40  циклов  ПЦР,  состоящих  из  трех  температурных  стадий:  95°  С,  55°  С,  72°  С  и  добавочный  цикл  с  72°  С  —  2  мин.  обеспечивающий  более  результативную  элонгацию.  Так  же  в  постановку  ПЦР  включался  отрицательный  контрольный  образец,  имеющий  все  компоненты  для  реакции,  кроме  ДНК.  В  ПЦР  смесь  входят:  Н₂О  15  мкл;  Mix  5  мкл;  праймеры  F+R  2+2  мкл;  ДНК  1  мкл.  Праймеры,  использованные  в  работе,  специфичны  к  двум  локусам  встройки  инсерционной  последовательности  бактерии  (IS5  —  WD0516/7  и  IS5  —  WD1310)  и  двум  минисателлитным  повторам  (VNTR  —  141  и  VNTR  —  105)  [1,  с.  415].

С  наработанными  фрагментами  проводился  горизонтальный  гель-электрофорез.  Брался  1,5  %  агарозный  гель,  состоящий  из:  агарозы,  TAE  и  бромиcтого  этидия.  Гель  помещался  в  камеру,  заполненную  буферным  раствором,  в  него  добавлялось  ДНК,  смешанное  с  загрузочным  буфером,  и  молекулярный  маркер,  содержащий  фрагменты  известной  длины.  Камера  закрывалась  и  к  образцам  прикладывалось  электрическое  поле  3  V/см  35-60  мин.  ДНК,  имея  отрицательный  заряд,  двигалось  от  катода  к  аноду. 

При  анализе  электрофоретического  разделения  продуктов  визуализация  происходит  под  действием  ультрафиолета.  Размер  фрагмента  ДНК  сравнивается  с  линейкой  и  положением  относительно  других  фрагментов.  Полученные  данные  о  скорости  прохождения  ДНК  фрагментом  агарозного  геля  имело  узнаваемое  соответствие  с  каким  либо  генотипом  Wolbachia  [4,  с.  2].

Таблица  2.

Генотипы  Wolbachia.

Сравнивая  полученную  электрофоретическую  картину  и  табличные  данные,  можно  подтвердить  видовую  принадлежность  данной  особи  или  установить  к  какой  лабораторной  линии  она  относится,  так  как  при  постоянном  поддержании  не  исключена  ошибка  с  переносом  генетического  материала  из  одной  линии  в  другую.  Тогда  процедура  генотипирования  может  заменить  контроль  качества  этих  линий.

Список  литературы:

1. Илинский  Ю.Ю.,  Быков  Р.А.,  Захаров  И.К.  Цитотипы  мутантных  линий  Drosophila  melanogaster  фонда  лаборатории  генетики  популяций  института  цитологии  и  генетики  со  ран:  генотипы  эндосимбионта  Wolbachia  и  митотипы  вида-хозяина  //  Вавиловский  журнал  генетики  и  селекции  —  2013  —  том  17,  —  №  3  —  С.  407—415.
2. Медведев  Н.Н.  Практическая  генетика  //  Академия  Науки  СССР  —  1968  —  №  2.  —  С.  46—47.
3. Ilinsky  Yu.  Coevolution  of  Drosophila  melanogaster  mtDNA  and  Wolbachia  Genotypes  //  PLoS  ONE  8(1):  e54373.  doi:10.1371/journal.pone.0054373
4. Ilinsky  Yu,  Zakharov  I  (2007)  Infection  of  the  Uman’  population  of  Drosophila  melanogaster  with  the  cytoplasmic  endosymbiont  Wolbachia  //  Dokl  Biol  Sci  413:  166—168.  doi:  10.1134/s0012496607020238.
5. Ilinsky  Yu,  Zakharov  I  (2007)  The  endosymbiont  Wolbachia  in  Eurasian  populations  of  Drosophila  melanogaster  //  Russ  J  Genet  43:  748—756.  doi:  10.1134/s102279540707006x.
6. Pieter  A.  Arnold,  Karyn  N.  Johnson  and  Craig  R.  White  Physiological  and  metabolic  consequences  of  viral  infection  in  Drosophila  melanogaster  //  The  Journal  of  Experimental  Biology  1  September  2013:  3350—3357.
7. Werren  J.H.  (1997)  Biology  of  Wolbachia  //  Annu  Rev  Entomol  42:  587–609.  doi:  10.1146/annurev.ento.42.1.587