НАКОПЛЕНИЕ  АЛЬГИНАТА  И  ПОЛИ-3-ГИДРОКСИБУТИРАТА  КУЛЬТУРОЙ  AZOTOBACTER  VINELANDII  ПРИ  КУЛЬТИВИРОВАНИИ  С  РАЗНОЙ  ЧАСТОТОЙ  ПЕРЕМЕШИВАНИЯ

Немойкина  Анна  Леонидовна

канд.  биол.  наук,  зав.  лабораторией  биополимеров  и  биотехнологии  Национального  исследовательского  Томского  государственного  университета,  РФ,  г.  Томск

E-mail: 

ALGINATE  AND  POLY-3-HYDROXYBUTYRATE  ACCUMULATION  IN  AZOTOBACTER  VINELANDII  CULTURES  WHEN  CULTURED  UNDER  VARIABLE  SHAKING  SPEED

Anna  Nemoykina

candidate  of  Science,  Head  of  Laboratory  of  biopolymers  and  biotechnology,

Tomsk  State  University,  Russia,  Tomsk

АННОТАЦИЯ

Целью  работы  было  оценить  накопление  альгината  и  поли-3-гидроксибутирата  бактерией  Azotobacter  vinelandii  БИМ  В-216  при  культивировании  в  колбах  с  разной  частотой  перемешивания.  При  частоте  перемешивания  200  об/мин  наблюдали  высокую  конверсию  источника  углерода  в  альгинат,  в  то  время  как  при  100  об/мин  источник  углерода  преобразуется  в  ПГБ.  Максимальная  концентрация  биомассы  (4,2  ±  0,1  г/л)  была  получена  в  культурах,  выращенных  при  200  об/мин

ABSTRACT

The  objective  of  this  study  was  to  evaluate  the  alginate  and  poly-3-hydroxybutyrate  accumulation  by  Azotobacter  vinelandii  bacterium  (BIM  B-216)  when  cultured  in  flasks  under  variable  shaking  speed.  Highest  levels  of  carbon  to  alginate  conversion  were  observed  at  200  rpm,  while  culturing  at  100  rpm  resulted  in  carbon  to  PHB  conversion.  The  maximum  biomass  concentration  (4,2  ±  0,1  g  /  l)  was  obtained  in  cultures  grown  at  200  rpm.

Ключевые   слова:  Azotobacter  vinelandii;  альгинат;  поли-3-гидроксибутират.

Keywords:  Azotobacter  vinelandii;  alginate;  poly-3-hydroxybutyrate.

Большое  количество  микроорганизмов,  включая  бактерии,  микроводоросли,  дрожжи  и  грибы,  могут  производить  внеклеточные  полисахариды.  Эти  микробные  экзополисахариды  представляют  потенциальный  интерес  с  экономической  точки  зрения,  в  зависимости  от  их  структурных  свойств  [7,  9].  Большой  интерес  на  сегодняшний  день  представляют  бактерии  Azotobacter  vinelandii.  Из  литературных  данных  известно,  что  данная  культура  способна  продуцировать  в  среду  полисахариды,  в  том  числе  и  альгинаты,  которые  образуют  гели  различной  плотности  [3,  8]. 

Альгинаты  широко  используются  в  качестве  загустителей,  стабилизаторов,  гелеобразующих  агентов  и  эмульгаторов  в  пищевой,  текстильной,  бумажной  и  фармацевтической  промышленности  [6].

Наряду  с  альгинатами  клетки  азотобактера  способны  синтезировать  биополимер  поли-3-гидроксибутират  (ПГБ).  Данный  полимер  не  токсичен,  сырьевые  ресурсы  его  производства  возобновляемы,  продукты  распада  не  вызывают  вредного  воздействия  на  организм  и  ухудшение  экологии  [1].  ПГБ  используется,  как  альтернативный  упаковочный  материал  способный  к  разложению  в  почве  и  воде  [2].

  Целью  настоящей  работы  было  оценить  влияние  частоты  перемешивания  на  накопление  альгината  и  ПГБ  бактерией  Azotobacter  vinelandii  БИМ  В-216.

Azotobacter   vinelandii  БИМ  В-216  предоставлен  Белорусской  коллекцией  непатогенных  микроорганизмов.  Культурально-морфологические  признаки  штамма:  колонии  крупные,  слизистые;  клетки  овальной  формы,  подвижные,  расположенные  одиночно,  парами,  иногда  группами,  граммотрицательные,  эндоспор  не  образуют.  Физико-биохимические  признаки:  строгий  аэроб,  каталазоположительный,  продуцирует  зеленый  водорастворимый  флюоресцирующий  пигмент.

Культуру  бактерий  выращивали  на  среде,  г/л:  сахароза  —  20;  дрожжевой  экстракт  —  3;  К₂НРО4  —  0,66;  КН₂РO₄  —  0,16;  CaSO₄  —  0,05;  NaCl  —  0,2;  Mg  SO₄·7H₂O  —  0,2;  Na₂MoO₄·2H₂O  —  0,0029;  FeSO₄  —  0,027.  рН  доводили  до  7,2.  В  колбы  объемом  500  мл  наливали  по  100  мл  среду,  культивировали  при  28  ºС. 

Альгинат  из  культуральной  жидкости  осаждали  изопропиловым  спиртом  (2  объема  спирта  :  1  объем  культуральной  жидкости).  Осадок  собирали  центрифугированием  (15  мин  при  7500  об/мин)  с  последующей  фильтрацией.  Осадок  промывали  изопропиловым  спиртом  до  постоянной  массы.  Все  измерения  проводили  в  трех  повторностях.  ПГБ  выделяли  по  методике  описанной  ранее  [5]. 

При  частоте  перемешивания  200  об/мин  наблюдали  высокую  конверсию  источника  углерода  в  альгинат,  в  то  время  как  при  100  об/мин  источник  углерода  преобразуется  в  ПГБ  (Табл.  1).

Таблица  1.

Характеристик  штамма  Azotobacter  vinelandii   при  культивировании  с  разной  частотой  перемешивания

Рисунок  1  показывает  типичные  кривые  роста  Azotobacter  vinelandii  при  частоте  вращения  100  и  200  об/мин.  Максимальная  концентрация  биомассы  (4,2  ±  0,1  г/л)  была  получена  в  культурах,  выращенных  при  200  об/мин.  При  перемешивании  с  частотой  100  об/мин  концентрация  биомассы  достигала  в  конце  культивирования  3,7  ±  0,2  г/л  (Табл.  1)

Максимальные  значения  накопления  ПГБ  были  75  ±  2  %  (по  отношению  к  общей  сухой  массы)  и  62  ±  3  %  в  культурах,  выращенных  при  100  и  200  об/мин  соответственно.

Выявили,  что  максимальное  содержание  биомассы  клеток  и  альгината  наблюдается  на  2  сутки  культивирования  и  в  дальнейшем  достоверно  не  увеличивается  (Рис.  1,  Рис.  2).

Рисунок  1.  Рост  биомассы  Azotobacter  vinelandii  при  культивировании  с  разной  частотой  перемешивания

Рисунок  2.  Накопление  альгината  бактерией  Azotobacter  vinelandii  при  культивировании  с  разной  частотой  перемешивания

Вязкость  культуральной  жидкости  бактерии  Azotobacter  vinelandii  БИМ  В-216  через  72  ч  культивирования  составляла  3,63  Па·с  (36,3  Пуаз).

Список   литературы:

1.Bonartsev  A.P.,  Iordanskii  A.L.,  Bonartseva  G.A.  and  Zaikov  G.E.  Biodegradation  and  Medical  Application  of  Microbial  Poly  (3-Hydroxybutyrate).  //Polymers  Research  Journal.  —  2008.  —  Vol.  2(2).  —  P.  127—160.

2.Chen  G.Q.,  Wu  Q.  The  application  of  polyhydroxyalkanoates  as  tissue  engineering  materials  //  Biomaterials.  —  2005.  —  Vol.  26(33).  —  P.  6565—6578.

3.Draget  I.,  Taylor  C.  Chemical,  physical  and  biological  properties  of  alginates  and  their  biomedical  implications  //  Food  Hydroc.  —  2011.  —  V.  25.  —  P.  251—256.

4.Galindo  E,  Peña  C,  Núñez  C,  Segura  D,  Espín  G.  Molecular  and  bioengineering  strategies  to  improve  alginate  and  polyhydroxyalkanoate  production  by  Azotobacter  vinelandii  //  Microb  Cell  Fact.  —  2007.  —  Vol.  6(7).  doi:  10.1186/1475-2859-6-7.

5.Peña  C.,  Campos  N.,  Galindo  E.  Changes  in  alginate  molecular  mass  distribution,  broth  viscosity  and  morphology  of  Azotobacter  vinelandii  cultured  in  shake  flasks  //Appl  Microbiol  Biotechnol.  —  1997.  —  Vol.  48.  —  Vol.  510—515.

6.Sabra  W.,  Zeng  A.P.,  Deckwer  W.D.  Bacterial  alginate:  physiology,  product  quality  and  process  aspects  //Appl  Microbiol  Biotechnol.  —  2001.  —  Vol.  56.  —  P.  315—325.

7.Saude  N.,  Junter  G.-A.  Production  and  molecular  weight  characteristics  of  alginate  from  free  and  immobilized-cell  cultures  of  Azotobacter  vinelandii//  Process  Biochemistry.  —  2002.  —  Vol.  37(8).  —  P.  895—900.

8. Skjak-Braec  G,  Espevic  T.  Application  of  alginate  gels  in  technology  and  biomedicine  //  Carbohydr.  Eur.  —  1996.  —  V.  14.  —  P.  19—23.

9.Sutherland  I.W.  The  properties  and  potential  of  microbial  exopolysaccharides//  ChimOggi.  —  1990.  —  Vol.  8  (9).  —  P.  9—14.