ВЛИЯНИЕ  ФТОРХИНОЛОНОВ  НА  ЦИТОАРХИТЕКТОНИКУ  ЭРИТРОЦИТОВ  ЧЕЛОВЕКА

Баева  Елена  Сергеевна

аспирант,  Воронежский  государственный  университет,  г.  Воронеж

Артюхов  Валерий  Григорьевич

зав.  кафедрой  биофизики  и  биотехнологии,  д-р  биол.  наук,  профессор  Воронежского  государственного  университета,  г.  Воронеж

E-mail: 

THE  INFLUENCE  OF  FLUOROQUINOLONES  ON  THE  CYTOARCHITECTONICS  OF  HUMAN  ERYTHROCYTES

Bayeva  Elena

post-graduate  student,  Voronezh  State  University,  Voronezh

Artyukhov  Valeriy

Head  of  Biophysics  and  Biotechnology  Department,  Doctor  of  Biology  Sciences,  Professor  of  Voronezh  State  University,  Voronezh

АННОТАЦИЯ

Методом  сканирующей  электронной  микроскопии  исследовано  влияние  фторхинолонов  (ципрофлоксацин,  офлоксацин,  спарфлоксацин)  на  морфофункциональное  состояние  эритроцитов  донорской  крови.  Показано,  что  антибиотики  обладают  определенной  мембранотропностью  к  эритроцитарным  мембранам  и  индуцируют  гетерогенные  изменения  поверхностной  архитектоники  в  популяции  эритроцитов.  Установлено,  что  уровень  активности  антибиотиков  определяется  их  концентрацией  в  инкубационной  среде. 

ABSTRACT

By  the  method  of  scanning  electron  microscopy  the  influence  of  fluoroquinolones  (ciprofloxacin,  ofloxacin,  sparfloxacin)  on  erythrocyte’s  morphology  of  blood  donors  has  been  investigated.  It  has  been  demonstrated  that  antibiotics  being  studied  reveal  a  certain  affinity  with  the  erythrocyte’s  membranes  and  induce  heterogeneous  changes  of  the  surface  architectonics  in  erythrocyte’s  population.  It  has  been  established  that  the  level  of  activity  of  antibiotics  is  determined  by  their  concentration  in  the  incubation  medium.

Ключевые  слова:  антибиотики,  фторхинолоны,  сканирующая  электронная  микроскопия,  эритроциты 

Keywords:  antibiotics,  fluoroquinolones,  scanning  electron  microscopy,  erythrocytes

Антибиотики  класса  фторхинолоны  —  эффективные  лекарственные  средства  нового  поколения  [9,  12,  15—17].  Их  активное  использование  в  терапии  воспалительных  процессов  обусловлено  рядом  фармакокинетических  преимуществ,  обусловленных  уникальной  стереохимией  молекул.  Являясь  малотоксичными  соединениями,  фторхинолоны  различаются  по  характеру  антимикробной  активности,  фармакокинетике  и  особенностям  токсикологии  [10]. 

Известно,  что  фторхинолоны  способны  оказывать  стимулирующее  действие  на  фагоцитарную  активность  полинуклеаров  и  макрофагов,  увеличивать  образование  перекиси  водорода  полиморфноядерными  лейкоцитами,  продукцию  интерлейкина-2,  а  у  больных  сахарным  диабетом  фторхинолоны  могут  вызывать  дисгликемии  [13].  Наличие  в  составе  молекулы  сопряжённых  π-электронных  систем  позволяет  фторхинолонам  в  условиях  избыточной  инсоляции  проявлять  фототоксический  эффект  [14].  Таким  образом,  использование  фторхинолонов  в  терапии  инфекционных  процессов  зачастую  сопровождается  проявлением  ими  неантибактериальных  эффектов  различного  рода,  которые  необходимо  учитывать  при  выборе  оптимальных  схем  лечения  пациентов  с  минимальным  риском  развития  побочных  эффектов.

В  наших  предыдущих  исследованиях  было  установлено,  что  некоторые  фторхинолоны  (ципрофлоксацин,  офлоксацин,  спарфлоксацин)  обладают  определенной  степенью  мембранотропности  к  эритроцитарным  клеткам  человека  [2].  Проникая  в  эритроциты,  данные  антибиотики  индуцируют  изменение  конформационного  состояния  внутриэритроцитарного  гемоглобина  при  комплексировании  с  ионогенными  группами  белка  [1].  Учитывая,  что  при  воздействии  на  организм  человека  различных  факторов  и  при  развитии  патологии  изменение  конфигурации  эритроцитов,  сопровождаемое  варьированием  их  размеров,  сдвигами  в  содержании  внутриклеточного  гемоглобина,  имеет  диагностическую  значимость  [4],  представляло  интерес  исследовать  поверхностную  архитектонику  эритроцитов  в  присутствии  фторхинолонов.

Методика  исследования.  В  качестве  модифицирующих  агентов  мы  использовали  антибиотики  в  форме  порошка:  ципрофлоксацин  (ЦФ)  —  1,21*10^-4  моль/л,  1,21*10^-5  моль/л  (Ciprofloxacin,  ≥  98,0  %  (HPLC)  Sigma-Aldrich),  офлоксацин  (ОФ)  —  1,1*10^-4  моль/л,  1,1*10^-5  моль/л  (Ofloxacin,  Sigma-Aldrich),  спарфлоксацин  (СФ)  —  1,02*10^-4  моль/л,  1,02*10^-5  моль/л  (Sparfloxacin,  98  %  (HPLC)  Sigma-Aldrich).  Навеску  антибиотиков  разводили  в  изотоническом  растворе  хлорида  натрия  и  использовали  в  эксперименте.  Ввиду  того,  что  в  плановой  практической  медицине  больному  назначают  лекарственное  средство  в  средней  терапевтической  дозе  [7],  в  своих  исследованиях  расчет  концентрации  антибиотиков  проводили  с  учетом  разовой  дозы  препаратов,  которая  соответствует  единичной  терапевтической  дозе  антибиотиков:  ЦФ  —  250  мг,  ОФ  —  200  мг,  СФ  —  200  мг. 

Поверхностную  архитектонику  эритроцитов  крови  доноров  изучали  методом  сканирующей  электронной  микроскопии  (СЭМ)  [8,  11].  Эритроциты  предварительно  инкубировали  в  течение  60  мин  с  антибиотиками.  Затем  контрольные  и  опытные  образцы  фиксировали  2,5  %  раствором  глутарового  альдегида  (Sigma,  США)  при  температуре  4  ºС  в  течение  1  ч.  Производили  обезвоживание  клеток  путем  центрифугирования  в  серии  водных  растворов  этанола  восходящей  концентрации  30  %,  50  %,  70  %,  90  %  и  далее  —  ацетоном.  Приготовленную  суспензию  эритроцитов  наносили  на  алюминиевые  подложки  и  высушивали  в  термостате  при  37  ºС.  Для  обеспечения  электропроводности  объектов  их  напыляли  тонкой  плёнкой  золота.  Препараты  просматривали  на  сканирующем  электронном  микроскопе  JSM-6380  LU  (Япония)  при  ускоряющем  напряжении  20—25  кВ,  увеличении  х1300  и  х14000  . 

Структурно-функциональную  характеристику  мембран  эритроцитов  оценивали  по  классификации,  предложенной  [5,  6].  Для  детального  анализа  характера  изменения  поверхностной  архитектоники  эритроцитов  рассчитывали  ряд  индексов:  1)  ИТ  —  индекс  трансформации  —  количественная  оценка  соотношения  патологических  и  нормальных  форм  эритроцитов  [3]:  ИТ=(ОД%+НД%)/Д%,  где  Д%  —  процент  дискоцитов,  ОД%  —  процент  обратимо  деформированных  эритроцитов,  НД%  —  процент  необратимо  деформированных  эритроцитов;  2)  ИОТ  —  индекс  обратимой  трансформации  (С.Б.  Назаров,  1995):  ИОТ=%ОД/%Д;  3)  ИНОТ  —  индекс  необратимой  трансформации:  ИНОТ=%НД/%Д.

Статистическую  обработку  результатов  исследования  проводили  с  использованием  параметрических  критериев  и  стандартных  пакетов  Microsoft  Excel.  Подсчет  клеток  производился  в  процентах  на  300  клеток. 

Результаты  исследования.  В  норме  большинство  эритроцитов  представлены  дискоцитами  (до  97  %).  Согласно  классификации  эритроцитов,  предложенной  [5,  6],  в  наших  исследованиях  контрольный  образец  содержал  91,4  %  дискоцитов,  6%  обратимо  деформированных  клеток  (дискоциты  с  одним  выростом,  дискоциты  с  гребнем,  дискоциты  с  множественными  выростами,  эритроциты  в  виде  тутовой  ягоды)  и  2,6  %  необратимо  деформированных  (куполообразные  эритроциты,  сфероциты  с  гладкой  поверхностью,  сфероциты  с  шипиками  на  поверхности,  эритроциты  в  виде  «спущенного»  мяча,  дегенеративные  формы  эритроцитов),  что  соответствует  морфологической  картине  красных  клеток  крови  здорового  человека. 

Исследование  рельефа  поверхности  эритроцитов,  модифицированных  антибиотиками  ЦФ,  ОФ,  СФ,  методом  сканирующей  электронной  микроскопии  показало  дозозависимое  снижение  количества  двояковогнутых  дискоцитов  (в  среднем  на  3—5  %)  и  увеличение  доли  необратимо  деформированных  эритроцитов  относительно  контроля.  Полученные  данные  свидетельствуют  об  изменении  поверхностной  архитектоники  эритроцитов  и,  как  следствие,  полиморфизма  эритроцитарной  популяции.  Количественная  оценка  изменения  соотношения  нормальных  и  патологических  форм  эритроцитов  после  модификации  антибиотиками  представлена  в  табл.  1,  2.

Таблица  1.

Цитоархитектоника  эритроцитов  крови  доноров,  модифицированных  антибиотиками  в  терапевтической  концентрации  (p<0,05)

Обозначения:  ЦФ  —  ципрофлоксацин  (1,21*10^-4  моль/л),  ОФ  —  офлоксацин  (1,1*10^-4  моль/л),  СФ  —  спарфлоксацин  (1,02*10^-4  моль/л)

Таблица  2. 

Цитоархитектоника  эритроцитов  крови  доноров,  модифицированных  антибиотиками  в  концентрации,  на  порядок  ниже  терапевтической  (p<0,05)

Обозначения:  ЦФ  —  ципрофлоксацин  (1,21*10^-5  моль/л),  ОФ  —  офлоксацин  (1,1*10^-5  моль/л),  СФ  —  спарфлоксацин  (1,02*10^-5  моль/л)

Как  следует  из  представленных  данных,  антибиотики  в  исследуемых  концентрациях  приводили  к  повышению  ИТ  клеток,  снижая  ИОТ  и  повышая  ИНОТ.  Под  действием  ЦФ  и  ОФ  в  терапевтической  концентрации  снизилось  количество  дискоцитов  (на  7  %,  p<0,05)  и  обратимых  форм  (на  16  %,  p<0,05),  значительно  повысилось  количество  необратимых  форм.  Выявленное  повышение  ИТ  и  ИНОТ  свидетельствует  о  низком  уровне  стерических  ограничений  для  взаимодействия  названных  фторхинолонов  с  эритроцитарными  клетками.  Электронные  микрофотографии  эритроцитов,  модифицированных  ЦФ  и  ОФ,  представлены  на  рис.  1,  2.

а)                             б)

Рисунок  1.  Электронные  микрофотографии  эритроцитов,  модифицированных  ципрофлоксацином  в  концентрациях  1,21*10^-4  моль/л  (а),  1,21*10^-5  моль/л  (б)

а)                            б)

Рисунок  2.  Электронные  микрофотографии  эритроцитов,  модифицированных  офлоксацином  в  концентрациях  1,1*10^-4  моль/л  (а),  1,1*10^-5  моль/л  (б)

Под  действием  СФ  в  обеих  исследованных  концентрациях  наблюдали  максимальное  снижение  количества  обратимо  деформированных  форм  клеток  относительно  контрольного  образца.  Электронные  микрофотографии  эритроцитов,  модифицированных  СФ,  представлены  на  рис.  3.

а)                               б)

Рисунок  3.  Электронные  микрофотографии  эритроцитов,  модифицированных  спарфлоксацином  в  концентрациях  1,02*10^-4  моль/л  (а),  1,02*10^-5  моль/л  (б)

Установленное  в  опыте  изменение  морфологической  картины  эритрона  под  действием  изучаемых  фторхинолонов  указывает  на  нарушение  эластичности  мембран,  а,  следовательно,  на  возможное  изменение  способности  эритроцитов  к  упругой  деформации  в  микроциркуляторном  русле. 

Выявленные  особенности  взаимодействия  ципрофлоксацина,  офлоксацина,  спарфлоксацина  с  эритроцитарными  клетками  указывают  на  необходимость  строгого  соблюдения  режима  дозирования  и  контроля  морфологической  картины  эритрона,  так  как  оптимальная  доза  должна  нести  максимально  благоприятный  терапевтический  эффект. 

Список  литературы:

1.Баева  Е.С.  Изучение  механизмов  взаимодействия  антибиотиков  различных  классов  с  гемоглобином  /  Е.С.  Баева,  С.Г.  Резван,  В.Г.  Артюхов  //  Вестник  Воронежского  государственного  университета.  Серия:  Химия.  Биология.  Фармация.  Воронеж,  —  2012.  —  №  2.  —  С.  119—124. 

2.Баева  Е.С.  Влияние  антибиотиков  класса  фторхинолоны  на  структурное  состояние  гемоглобина  человека  /  Е.С.  Баева,  В.Г.  Артюхов  //  Вопросы  биол.,  мед.  и  фарм.  Химии.  М.,  —  2013.  —  №  7.  —  С.  65—69. 

3.Кидалов  В.Н.  Трансформация  и  ультраструктурные  изменения  эритроцитов  при  сенсибилизации  организма  сывороточным  белком  /  В.Н.  Кидалов,  К.К.  Зайцева  //  Бюл.  эксперим.  биологии  и  медицины.  —  1986.  —  Т.  11,  —  №  7.  —  С.  112—114.

4.Кидалов  В.Н.  Саногенез  и  саногенные  реакции  эритрона.  Проблемы  медицины  и  общее  представление  о  саногенезе  /  В.Н.  Кидалов,  А.А.  Хадарцев,  Г.Н.  Якушина  //  Вестник  новых  медицинских  технологий.  —  2005  —  Т.  12,  —  №  3—4  —  С.  5—10. 

5.Козинец  Г.И.  Поверхностная  архитектоника  клеток  периферической  крови  /  Г.И.  Козинец,  Ю.  Симоварт.  Таллин:  Валгус,  1984.  —  116  с.

6.Козинец  Г.И.  Диагностическая  значимость  морфологических  особенностей  эритроцитов  в  мазках  периферической  крови  /  Г.И.  Козинец,  В.М.  Погорелов  //  Гематология  и  трансфузиология.  —  2005.  —  №  5.  —  С.  13—17.

7.Логинова  Н.В.  Введение  в  фармацевтическую  химию  /  Н.В.  Логинова,  Г.И.  Полозов.  Мн.:  Изд-во  БГУ,  2004.  —  251  с. 

8.Новицкий  В.В.  Поверхностная  архитектоника  эритроцитов  периферической  крови  у  психических  больных  /  В.В.  Новицкий,  Н.В.  Рязанцева,  И.Р.  Семин  //  Бюл.  эксперим.  биологии  и  медицины.  —  2000.  —  Т.  130,  —  №  10.  —  С.  429—432.

9.Падейская  Е.Н.  Переносимость  и  безопасность  антимикробных  препаратов  группы  фторхинолонов;  редкие  и  очень  редкие  нежелательные  явления  /  Е.Н.  Падейская  //  Инфекция  и  антимикробная  терапия.  —  2001.  —  №  3.  —  С.  4—13. 

10.Полищук  А.В.  Эксимерообразование  фторхинолонов  в  растворах  /  Международный  симпозиум  по  сорбции  и  экстракции:  материалы  //  (под  общей  ред.  д.х.н.  Медкова  М.А.).  Владивосток  :  Дальнаука,  2008.  —  332  с. 

11.Рязанцева  Н.В.  Ультраструктурные  изменения  эритроцитов  при  психических  расстройствах  //  Н.В.  Рязанцева,  В.В.  Новицкий  [и  др.]  /  Бюл.  эксперим.  биологии  и  медицины.  —  2001.  —  Т.  132,  —  №  10.  —  С.  469—472.

12.Сидоренко  С.В.  Роль  хинолонов  в  антибактериальной  терапии.  Механизм  действия,  устойчивость  микроорганизмов,  фармакокинетика  и  переносимость  /  С.В.  Сидоренко  //  Рус.  Мед.  журнал.  —  2003.  —  Т.  11,  —  №  18.  —  С.  1036—1040. 

13.Симонов  С.С.  Неантибактериальные  эффекты  антибиотиков  /  С.С.  Симонов  //  Здоров’я  України.  —  2007.  —  №  5.  —  С.  22—23. 

14.Яковлев  В.П.  Клиническая  фармакология  фторхинолонов  /  В.П.  Яковлев,  С.В.  Яковлев  //  Клиническая  фармакология  и  терапия.  —  1994.  —  Т.  3,  —  Вып.  2.  —  С.  53—58. 

15.Grossman  R.F.  The  role  of  fluoroquinolones  in  respiratory  tract  infections  /  R.F.  Grossman  //  J.  Antimicrob.  Chemother.  —  1997.  —  Vol.  40  (Suppl.A).  —  P.  59—62. 

16.Lopatin  A.V.  Fluoroquinolones  in  prophylaxis  of  suppurative  in  paediatric  craniofacial  surgery  /  A.V.  Lopatin,  O.Y.  Mokhov  //  Journal  of  Cranio-Maxillo-Facial  Surgery.  —  1998.  —  Vol.  6.  —  P.  106. 

17.Sarkozy  G.  Quinolones:  a  class  of  antimicrobial  agents  /  G.  Sarkozy  //  Vet.  Med.  Czech.  —  2001.  —  Vol.  46,  —  №  9—10.  —  P.  257—274.