ИЗУЧЕНИЕ  ПРИЖИВАЕМОСТИ  ШТАММА  AGROBACTERIUM  RADIOBACTER  204  В  РИЗОСФЕРЕ  ВИНОГРАДНОГО  РАСТЕНИЯ

Клименко  Нина  Николаевна

аспирант,  Институт  агроэкологии  и  природопользования  НААН  Украины,  Украина,  г.  Киев

E-mail: 

THE  STUDY  OF  STRAIN  AGROBACTERIUM  RADIOBACTER  204  SURVIVAL  RATE  IN  THE  GRAPE  RHIZOSPHERE  PLANTS

Klymenko  Nina

postgraduate,  Institute  of  Agroecology  and  Environmental  Management  of  NAAS  of  Ukraine,  Ukraine,  Kyiv

АННОТАЦИЯ

Целью  работы  было  изучение  способности  азотфиксирующего  микроорганизма  Agrobacterium  radiobacter  204  приживаться  в  ризосфере  виноградного  растения  под  воздействием  антибиотиков.  Для  этого  были  выделены  антибиотикоустойчивые  штаммы  данного  микроорганизма,  устойчивые  к  действию  стрептомицина,  ампициллина  и  канамицина.  Установлено,  что  антибиотикорезистентные  мутанты  способны  приживаться  в  ризосфере  винограда  и  их  численность  постепенно  снижалась  на  протяжении  исследования.  Таким  образом,  штамм-основа  биопрепарата  Диазофит  действительно  способен  приживаться  в  ризосфере  винограда.

ABSTRACT

The  aim  of  this  work  was  to  study  the  ability  of  nitrogen-fixing  microorganism  Agrobacterium  radiobacter  204  to  survive  in  the  grape  plants  rhizosphere  under  the  influence  of  antibiotics.  For  this  purpose  there  were  selected  antibiotic-resistant  strains  of  this  microorganism  resistant  to  streptomycin,  ampicillin,  and  kanamycin.  It  was  established  that  antibiotic-resistant  mutants  are  able  to  survive  in  the  rhizosphere  of  grapes  and  their  quantity  gradually  decreased  throughout  the  study.  Thus,  the  strain  A.  radiobacter  204,  which  biological  preparation  Diazofit  based  on,  really  able  to  survive  in  the  grapes  rhizosphere.

Ключевые  слова:  Диазофит;  Agrobacterium  radiobacter  204;  антибиотикорезистентные  микроорганизмы;  ризосфера  виноградного  растения.

Keywords:  Diazofit;  Agrobacterium  radiobacter  204;  antibiotic-resistant  microorganisms;  grape  plant  rhizosphere.

Общеизвестно,  что  микробные  препараты,  используемые  при  выращивании  различных  сельскохозяйственных  культур,  обладают  целым  рядом  полезных  свойств.  Во-первых,  они  являются  экологически  безопасными  для  окружающей  среды  и  человека,  во-вторых,  способны  улучшать  рост  и  минеральное  питание  растений,  повышать  урожайность  и  устойчивость  к  неблагоприятным  факторам.  Также  штаммы-основы  бактериальных  препаратов  способны  влиять  на  микробоценозы  почвы  и  ее  физико-химические  свойства  [2;  8].  Однако  эффективность  использования  микробиологических  препаратов  зависит  от  способности  штаммов  к  приживаемости  в  ризосфере  того  или  иного  растения. 

Исследования  способности  микроорганизмов  приживаться  в  ризосфере  сельскохозяйственных  растений  проводились  многими  учеными.  Так,  было  установлено,  что  бактерии  родов  Azospirillum  и  Pseudomonas  способны  приживаться  в  ризосфере  озимой  ржи  [12].  В  условиях  вегетационных  опытов  на  вермикулите  и  почвенном  субстрате  изучена  способность  штаммов  Agrobacterium  radiobacter  10  [6]  и  Bacillus  [9]  приживаться  в  ризосфере  растений  капусты.  Выяснено,  что  исследованные  штаммы  хорошо  приживались  на  корнях  капусты,  и  их  численность  постепенно  снижалась  с  нескольких  миллионов  после  инокуляции  до  нескольких  десятков  колоний  в  конце  вегетации.

В  вегетационном  опыте  была  изучена  динамика  численности  интродуцированных  мутантов  диазотрофов  (Azospirillum  brazilense  11  и  Enterobacter  aerogenes  30)  в  почве  ризосферы  ярового  ячменя.  Выявлено,  что  эти  штаммы  способны  адаптироваться  и  активно  функционировать  на  поверхности  корней  данного  растения  [11].

В  литературных  источниках  можно  встретить  информацию  о  том,  что  в  ризосфере  культурных  растений  успешно  приживаются  не  только  бактериальные  штаммы,  но  и  микромицеты.  Так,  установлена  способность  штамма  Chaetomium  globosum  3250  приживаться  в  ризосфере  яровой  пшеницы  в  течение  вегетационного  периода  [10].  Через  20  суток  исследования  количество  этих  микроорганизмов  в  верхнем  слое  почвы  достигала  7,5—51·10³  колониеобразующих  единиц  (КОЕ).

Исследования,  проведенные  рядом  автором,  подтверждают,  что  штамм-основа  (Enterobacter  nimipressuralis  32-3)  микробного  препарата  Фосфоэнтерин  способен  приживаться  в  ризосфере  зерновых  и  овощных  культур  [1;  4;  5].

Однако  способность  штамма  A.  radiobacter  204  приживаться  в  ризосфере  виноградного  растения  исследована  недостаточно  глубоко.  Поэтому  целью  нашей  работы  было  изучение  приживаемости  штамма-основы  микробного  препарата  Диазофит  в  почве  ризосферы  винограда. 

Материалы  и  методы.  Азотфиксирующий  штамм  A.  radiobacter  204  является  основой  микробного  препарата  Диазофит.  Данный  препарат  рекомендуется  для  улучшения  азотного  питания  растений.  Кроме  азотфиксирующей  активности,  обладает  ростостимулирующими  и  биопротекторными  свойствами.  Исследования  проводили  в  условиях  вегетационного  опыта  с  виноградом  сорта  Мускат  белый  на  подвое  Шасла  х  Берландиери  41  Б.  Продолжительность  опыта  составляла  70  суток.  Приживаемость  A.  radiobacter  204  в  ризосфере  винограда  изучали  при  помощи  его  стрептомицин-,  ампициллин-  и  канамицинрезистентных  мутантов.  Антибиотикорезистентные  мутанты  были  получены  по  методике  [6].  Корневую  систему  саженцев  винограда  перед  высадкой  обрабатывали  суспензией  суточной  культуры  антибиотикорезистентных  бактерий  (10,2—11,5  млн.  КОЕ/мл):  6  мл  на  каждый  саженец.  Растения  высаживали  в  сосуды,  заполненные  лугово-аллювиальной  карбонатной  почвой.  Основные  характеристики  почвы:  запасы  гумуса  1,5—2,2  %;  содержание  подвижного  азота  11—18  мг/кг  почвы,  фосфора  —  32—38  мг/кг,  калия  —  260—430  мг/кг;  реакция  почвенного  раствора  рН  8,2—8,5;  содержание  карбонатов  15—37  %;  содержание  активной  извести  —  10—15  %.  Данные  почвенные  показатели  являются  оптимальными  для  выращивания  винограда.  Повторность  опыта  шестикратная.

Численность  антибиотикорезистентных  бактерий  в  ризосферной  почве  определяли  методом  глубинного  посева  определенных  разведений  почвенной  суспензии  на  питательную  среду  (гороховый  агар)  с  добавлением  антибиотиков:  стрептомицина  1500  ед./мл,  ампициллина  —  130  ед./мл,  канамицина  —  140  ед./мл,  повторность  пятикратная.  Образцы  почвы  для  контрольного  варианта  отбирали  в  ризосфере  растений,  корневая  система  которых  не  была  инокулирована.

Результаты  и  их  обсуждение.   Как  показали  наши  исследования,  изучаемый  штамм  был  наиболее  устойчив  к  действию  стрептомицина:  получен  мутант,  который  выдерживает  концентрацию  1500  ед./мл.  В  то  же  время  резистентность  мутантов,  полученных  для  ампициллина  и  канамицина,  не  превышала  130  и  140  ед./мл  соответственно. 

Установлено,  что  численность  стрептомицинрезистентных  микроорганизмов  A.  radiobacter  204  в  почве  ризосфере  на  14  сутки  опыта  составляла  15,20  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы  (рис.  1).  Через  28  и  42  суток  их  численность  несколько  снизилась:  до  12,78  и  12,07  млн.  соответственно.  Однако  на  56  сутки  с  момента  закладки  опыта  количество  колоний  полученного  мутанта  составляло  10,65  млн./г  сухой  почвы,  а  на  70  сутки  снизилось  до  5,44  млн./г  сухой  почвы.

На  протяжении  эксперимента  отмечено,  что  динамика  численности  бактерий,  которые  в  естественной  среде  устойчивы  к  воздействию  стрептомицина  (контроль),  была  ниже,  чем  у  мутанта  исследуемого  штамма.  Так,  количество  бактерий  в  контроле  на  протяжении  14—42  суток  постепенно  снижалось  с  9,71  до  9,60  и  8,88  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы  соответственно.  На  56  сутки  количество  микроорганизмов,  резистентных  к  действию  стрептомицина,  упало  до  6,24  млн.,  а  в  конце  исследования  составляла  всего  3,36  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы.

Рисунок  1.  Численность  стрептомицинрезистентных  микроорганизмов  штамма  A .  radiobacter  204  в  ризосфере  виноградного  растения

Похожая  тенденция  наблюдалась  и  для  ампициллинрезистентных  бактерий  (рис.  2).

Рисунок  2.  Численность  ампициллинрезистентных  микроорганизмов  штамма  A .  radiobacter  204  в  ризосфере  виноградного  растения

Так,  на  14  день  исследований  их  количество  в  почве  ризосферы  составляло  7,52,  на  28  и  42  сутки  —  7,47  и  7,28  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы  соответственно.  На  56  день  исследований  отмечено  снижение  их  числа  до  6,10  млн.  КОЕ,  а  в  конце  эксперимента  (на  70  сутки)  —  до  3,15  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы. 

Численность  микроорганизмов,  обладающих  естественной  устойчивостью  к  воздействию  ампициллина  (контроль),  на  протяжении  опыта  постепенно  снижалась  и  составляла  на  14,  28,  42  сутки:  6,91,  6,72  и  6,48  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы  соответственно.  На  56  день  опыта  количество  ампициллинрезистентных  бактерий  достигало  4,08,  а  на  70  сутки  —  2,16  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы. 

Нами  также  исследована  приживаемость  канамицинрезистентного  мутанта  в  ризосфере  виноградного  растения  (рис.  3).  Выявлено,  что  данный  микроорганизм  имел  наибольшую  численность  в  почве  по  сравнению  с  бактериями,  устойчивыми  к  действию  стрептомицина  и  ампициллина.  Так,  на  14  сутки  исследования  его  количество  составляло  17,02  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы. 

Рисунок  3.  Численность  канамицинрезистентных  микроорганизмов  штамма  A .  radiobacter  204  в  ризосфере  виноградного  растения

На  28  сутки  этот  показатель  составлял  13,64  млн.  КОЕ.  На  протяжении  42,  56  и  70  суток  численность  канамицинрезистентных  мутантов  в  ризосфере  снизилась:  до  13,43,  12,19  и  6,20  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы  соответственно.  Итак,  для  микроорганизмов,  устойчивых  к  канамицину,  сохраняется  та  же  тенденция,  что  и  для  предыдущих  резистентных  мутантов,  а  именно:  постепенное  снижение  их  численности  в  ризосферной  почве  винограда  на  протяжении  исследования. 

Численность  бактерий,  устойчивых  к  действию  канамицина  в  контроле,  также  постепенно  снижалась  на  протяжение  всего  периода  исследования.  Так,  на  14  и  28  сутки  она  составляла  12,32  и  12,24  КОЕ/г  сухой  почвы  соответственно.  На  42  сутки  количество  канамицинрезистентных  микроорганизмов  снизилось  до  12,00,  через  две  недели  (на  56  сутки)  —  до  10,56,  а  на  70  сутки  исследования  —  до  5,52  млн.  КОЕ/г  сухой  почвы.

Итак,  исследование  динамики  численности  антибиотикорезистентных  мутантов  штамма  A.  radiobacter  204  в  почве  показало,  что  они  способны  приживаться  в  ризосфере  виноградного  растения.  Эти  результаты  объясняют  данные,  полученные  нами  в  полевом  опыте,  а  именно:  использование  Диазофита  оказывает  положительное  влияние  на  рост,  развитие  и  урожайность  винограда  [3].

Таким  образом,  наши  результаты  свидетельствуют  о  том,  что  штамм  A.  radiobacter  204  действительно  способен  приживаться  в  ризосфере  винограда.  Установлено,  что  наибольшая  численность  бактерий  в  ризосферной  почве  отмечена  для  канамицинрезистентных  бактерий.

Список  литературы:

1.Баранская  М.И.  Способность  штамма  Enterobacter  nimipressuralis  32-3  приживаться  в  ризосфере  яровых  зерновых  /  М.И.  Баранская  //  Сельскохозяйственная  микробиология:  Межведомственный  тематический  научный  сборник.  Чернигов,  —  2008.  —  Вып.  7.  —  с.  101—108  (укр.). 

2.Завалин  А.А.  Применение  биопрепаратов  и  биологический  азот  в  земледелии  Нечерноземья  /  А.А.  Завалин,  Н.С.  Алметов.  М.:  Издательство  ВНИИА,  2009.  —  152  с.

3.Клименко  Н.Н.  Новое  в  технологии  выращивания  привитого  винограда  /  Н.Н.  Клименко,  О.Е.  Клименко,  Н.И.  Клименко,  А.Р.  Акчурин,  Л.А.  Чайковская  //  Виноградарство  и  виноделие:  межвед.  темат.  научн.  сборник.  Одесса:  ННЦ  «ИвиВ  им.  В.Е.  Таирова»,  —  2013.  —  Вып.  50.  —  с.  107—111  (укр.). 

4.Ключенко  В.В.  Размножение  бактерий  Enterobacter  nimipressuralis  32-3  в  ризосфере  озимой  пшеницы  /  В.В.  Ключенко,  М.И.  Баранская,  Л.А.  Чайковская  //  Сельскохозяйственная  микробиология.  —  2010.  —  Вып.  12.  —  с.  87—92  (укр.).

5.Мельничук  Т.Н.,  Пархоменко  Т.Ю.,  Татарин  Л.Н.  Интродукция  фосфатмобилизивного  штамма  Enterobacter  nimipressuralis  32-3  в  ризосферу  капусты  белоголовой  /  Т.Н.  Мельничук,  Т.Ю.  Пархоменко,  Л.Н.  Татарин  //  Фосфор  и  калий  в  земледелии.  Проблемы  микробиологической  мобилизации.  Чернигов-Харьков,  2004.  —  с.  81—85  (укр.).

6.Мельничук  Т.Н.  Некоторые  аспекты  эффективного  использования  биопрепаратов  при  выращивании  овощных  культур  /  Т.Н.  Мельничук,  В.Ф.  Патика,  Н.Г.  Осенний  //  Нетрадиционное  растениеводство,  экология  и  здоровье:  мат-лы  7  Междунар.  научно-практ.  конф.  Симферополь,  1998.  —  с.  441—442.

7.Методы  общей  бактериологии  /  под  ред.  Ф.  Герхардта  и  др.;  пер.  с  англ.:  в  3  т.  М.:  Мир,  —  1983.  —  Т.  2.  —  1984.  —  С.  29—31.

8.Микробные  препараты  в  земледелии.  Теория  и  практика  /  Под  ред.  В.В.  Волкогона.  К.:  Аграрная  наука,  2006.  —  312  с.  (укр.)

9.Пархоменко  Т.Ю.  Интродукция  штаммов  рода  Bacillus  в  ризосферу  капусты  //  Научные  записки  Тернопольского  национального  педагогического  университета  им.  Владимира  Гнатюка.  Серия:  Биология,  —  2007.  —  №  2  (32).  —  с.  101—103  (укр.). 

10.Патыка  В.Ф.  Способность  Chaetomium  globosum  Kunze  ex  FR.  приживаться  в  ризосфере  яровой  пшеницы  и  колонизировать  ее  корневую  систему  /  В.Ф.  Патика,  Е.П.  Копылов,  С.П.  Надкерничный  //  Микробиологический  журнал,  —  2007.  —  №  4,  том  69.  —  с.  54—62  (укр.).

11.Патыка  В.Ф.  Интродукция  азотфиксирующих  бактерий  в  корневой  зоне  ярового  ячменя  /  В.Ф.  Патыка,  Е.П.  Копылов  //  Агроэкологический  журнал,  —  2002.  —  №  3.  —  с.  26—29  (укр.). 

12.Maltseva  N.N.,  Nadkernichnaya  E.V.,  Kanivets  N.A.  Associations  of  nitrogen-fixing  bacteria  with  winter  rue  //  Proceedings  of  the  10^th  International  Congress  of  Nitrogen  Fixation  “Nitrogen  Fixation:  Fundamental  and  Applications”,  St.  Petersburg,  Russia,  1995.  Kluwer  Academic  Publisher.  Current  Plant  Science  and  Biotechnology  in  Agriculture.  —  Vol.  27,  —  1995.  —  p.  769.