ИЗУЧЕНИЕ СВОЙТВ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА L-ФНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИФЗЫ

Бабич  Ольга  Олеговна

к.  т.  н.,  доцент

Федеральное  государственное  бюджетное  образовательное  учреждение  высшего  профессионального  образования  «Кемеровский  технологический  институт  пищевой  промышленности»,  г.  Кемерово

E-mail:  Olich.43@rambler.ru

Отдельные  наследственные  нарушения  обмена  веществ  встречаются  относительно  редко  и  обусловлены  мутациями  –  изменениями  последовательности  нуклеотидов  ДНК.  Мутации  приводят  к  синтезу  дефектных  белков  (в  том  числе  -  структурных  белков,  ферментов,  гормонов,  факторов  роста,  белков-рецепторов).  Подавляющее  большинство  наследственных  нарушений  метаболизма  обусловлено  генетическими  дефектами  ферментов,  участвующих  в  обмене  аминокислот,  углеводов  и  липидов.  Патогенез  и  клинические  проявления  определяются  отсутствием  промежуточных  или  конечных  нормальных  метаболитов  и  накоплением  токсических  метаболитов.  Самые  частые  и  тяжелые  последствия  биохимических  дефектов  у  большинства  больных  -  умственная  отсталость  и  неврологические  расстройства.

Одним  из  наследственных  заболеваний  обмена  веществ  является  фенилкетонурия  -  наследственное  заболевание,  связанное  с  нарушением  метаболизма  аминокислоты  фенилаланина  и  мутацией  гена,  кодирующего  фермент  фенилаланин–4–гидрокислазу,  разрушающую  фенилаланин  до  тирозина.  В  то  время  как  нормальный  уровень  фенилаланина  в  плазме  крови  составляет  0,05  мМ,  у  пациентов  с  нарушением  метаболизма  фенилаланина  содержание  фенилаланина  может  достигать  1  мМ,  точнее  этот  уровень  колеблется  от  1  мМ  до  2,5  мМ.

L-фенилаланин  –  одна  из  незаменимых  аминокислот.  В  животном  организме  фенилаланин  необходим  для  синтеза  таких  соединений,  как  адреналин,  норадреналин,  катехоламин,  допамин,  так  же  как  тироидные  гормоны,  тироксин,  трийодотиронин  и  пигмент  меланин.  Растения  и  большинство  микроорганизмов  способны  синтезировать  фенилаланин  кислотным  способом.  При  нормальных  условиях  метаболизм  фенилаланина  происходит  путем  его  гидроксилирования  до  тирозина.  Нарушения  в  процессе  гидроксилирования  приводят  к  возникновению  фенилкетонурии.  У  больных  детей  в  крови  концентрация  фенилаланина  очень  высока,  а  тирозина  –  мала.

Хотя  диетотерапия  позволяет  снизить  содержание  фенилаланина  в  плазме  крови  до  0,3  мМ,  проблема  лечения  фенилкетонурии  является  достаточно  актуальной.  Так,  частота  патологии  среди  новорожденных  по  данным  массового  обследования  в  различных  странах  в  среднем  составляет  1:8000-1:10000.  Наиболее  часто  выявляются  больные  в  Северо-Западном  и  Уральском  федеральных  округах  (1:5000  новорожденных).

Таким  образом,  актуальна  проблема  разработки  новых  подходов  к  лечению  фенилкетонурии.  Например,  для  преодоления  разрушения  нейротрансмиттеров  серотонина  и  допамина  больные  фенилкетонурией  принимают  прекурсоры  нейротрансмиттеров  тирозин  и  триптофан.  Чтобы  уменьшить  поступление  фенилаланина  в  мозг,  пациенты  получают  добавки  линейных  нейтральных  аминокислот,  таких  как  валин,  изолейцин  и  лейцин.

В  настоящее  время  известно  несколько  способов  лечения  фенилкетонурии  и  других  нарушений  метаболизма  фенилаланина.  Один  из  способов  –  действие  фенилаланин-4-гидроксилазой  в  единственном  числе  или  в  комбинации  с  одним  или  несколькими  ферментами,  улучшающими  его  активность  в  процессах  метаболизма  фенилаланина.

Другим  перспективным  способом  преодоления  последствий  фенилкетонурии  является  использование  ферментного  препарата  L-фенилаланин-аммоний-лиазы  (pal,  КФ  4.3.1.5),  катализирующей  неокислительное  дезаминирование  L-фенилаланина  с  образованием  транс-коричной  кислоты  и  свободного  иона  аммония.

Целью  настоящих  исследований  является  определение  дополнительных  технологических  параметров  полученного  ферментного  препарата  pal. 

Определенные  успехи,  достигнутые  при  разработке  методов  низкотемпературного  консервирования  клеточных  суспензий  путем  экспериментального  варьирования  скоростей,  отвлекли  внимание  многих  исследователей  от  фундаментальных  разработок.  В  настоящее  время,  когда  накоплены  значительные  фактические  данные  о  механизмах  криоповреждения  и  криозащиты  биологических  объектов,  такой  подход  к  выбору  оптимального  режима  нельзя  считать  целесообразным.  Очевидно,  что  исход  криоконсервирования  зависит  от  ряда  взаимосвязанных  факторов,  которые  имеют  большое  значение  для  успешной  реализации  методов  низкотемпературного  консервирования.

Анализ  литературных  источников  по  данному  вопросу  показывает,  что  основное  внимание  исследователей  при  криоконсервировании  биообъектов  было  направлено  на  подбор  оптимальных  скоростей  замораживания,  в  то  время  как  процесс  оттаивания  считали  второстепенным.  Это  обусловлено,  с  одной  стороны,  отсутствием  технических  возможностей  для  получения  равномерного  и  быстрого  нагрева  механизмом  теплопроводности,  на  котором  основано  размораживание  на  «водяной  бане»,  с  другой  –  в  силу  слабой  изученности  применения  других  видов  энергии,  способной  обеспечить  заданный,  регулируемый  процесс  нагрева  биообъекта.

Работы  по  изучению  влияния  низких  температур  на  структурно-функциональное  состояние  белков  и  особенно  ферментов  в  последнее  время  связаны  не  только  с  интересами  криобиологии,  но  и  энзимологии.  Замедление  ферментативных  реакций,  вызываемое  низкими  температурами,  позволит  глубже  разобраться  в  механизмах  ферментативного  катализа.  Однако  для  этого  необходимо,  чтобы  низкие  температуры  не  приводили  к  нарушению  структуры  фермента,  а  температурная  зависимость  его  активности  подчинялась  закону  Аррениуса.  Действительно,  для  некоторых  ферментов  удалось  достигнуть  выполнения  соотношения  Аррениуса  вплоть  до  -70ºС  при  соответствующем  подборе  состава  растворителя.  Ценную  информацию  об  обратимости  структурно-функциональных  изменений,  вызванных  низкими  температурами,  может  дать  замораживание-оттаивание  растворов  ферментов  по  различным  программам.  К  тому  же  некоторые  работы  указывают  на  зависимость  степени  низкотемпературной  повреждаемости  их  от  скорости  охлаждения.  В  ряде  работ  высказано  предположение,  что  при  медленном  замораживании  повреждение  белков  вызывается  гиперконцентрацией  электролитов,  а  при  быстром  –  дегидратацией.

В  работе  провели  исследования  по  влиянию  замораживания  –  оттаивания  на  активность  рекомбинантной  PAL.  Первоначально  проверяли  устойчивость  фермента  к  замораживанию.  Однократная  заморозка  –  разморозка  показала,  что  потери  активности  фермента  в  этих  условиях  эксперимента  составляют  12  %  (табл.  1). 

В  последующих  экспериментах  в  процессе  диализа  потери  активности  фермента  не  происходило.  Диализованный  препарат  имел  удельную  активность,  равную  2,99  Е/мг  белка.  Концентрация  белка  составляла  8,51  мг/мл.

Таблица  1.  Результаты  определения  потери  активности  фермента  PAL  при  замораживании  –  оттаивании

Затем  три  образца  фермента  (с  добавлением  D-трегалозы,  поливинилпирролидона  и  Трис-HCl  буферного  раствора)  подвергали  сублимационной  сушке  и  оценивали  потери  активности  после  лиофилизации.  Контролем  служила  активность  препарата  после  диализа.  Результаты  определения  активности  фермента  до  и  после  лиофилизации  представлены  в  таблице  2.

Результаты,  представленные  в  табл.  2,  свидетельствуют  о  том,  что  наилучшим  стабилизатором  активности  PAL  при  лиофилизации  является  0,5  %  раствор  D-трегалозы.  Поливилилпирролидон  при  той  же  концентрации  характеризуется  меньшим  эффектом.  Кроме  того,  данное  соединение  проблематично  удалять  из  препаратов  белка,  поскольку  оно  сильно  поглощает  в  УФ-диапазоне.

Таблица  2.  Результаты  определения  потери  активности  фермента  PAL  при  лиофилизации

Таким  образом,  подобраны  условия  лиофилизации  рекомбинантной  L-фенилаланин-аммоний-лиазы.  Показано,  что  фермент  теряет  около  10  %  активности  при  однократном  цикле  замораживания  –  оттаивания  в  0,1  М  трис-HCl  буфере  (pH  8,5).  Использование  этого  же  буфера,  дополнительно  содержащего  0,5%  трегалозы,  позволяет  проводить  лиофилизацию  фермента  практически  без  потери  активности.