АНАЛИЗ МЕЖНУКЛЕОСОМНОЙ ДЕГРАДАЦИИ ДНК ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЖЕНЩИН ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МИОМАХ МАТКИ

THE ANALYSIS OF TRANSNUCLEOSOME DEGRADATION OF DNA LEUKOCYTES OF BLOOD CELLES WOMEN AT VARIOUS FORMS OF MYOMA UTERA

Landish Isanbaeva

docent,  Doctor of Philosophy. Ph.D. Tashkent Institute of Postgraduate Medical Education. Department of Obstetrics Gynecology and Perinatal Medicine,

Uzbekistan, Tashkent

АННОТАЦИЯ

До настоящего времени отсутствуют надежные критерии, позволяющие своевременно диагностировать и прогнозировать темп и характер роста миомы матки. Для  решения  данной проблемы  проведено изучение нарушений, происходящих в ядерном аппарате клетки, которые могут быть маркерами  ранней доклинической диагностики миом матки. Показано, что при различных миомах матки происходят нарушения в транскрипционной и репликационной системах лейкоцитов периферической крови, причиной которых являются межнуклеосомной деградация ДНК и изменение активности ДНК- топоизомеразы.

ABSTRACT

Till now there are no reliable criteria allowing in due time to diagnose and predict rate and character of growth of myomas utera.  For the decision of the given problem studying the infringements occurring in the nuclear device of cell which can be markers early diagnostics of myomas utera. It is shown, that at various myomas utera there are infringements in transcriptional and replicative system of leucocytes of peripheral blood which reason are transnucleosome degradation of DNA and change of activity DNA-topoizomerase.

Ключевые  слова: миома матки; межнуклеосомной деградации ДНК лейкоцитов; транскрипция; репликация;  ДНК топоизомераза.

Keywords: myoma  of uterus;   transnucleosome degradation of DNA leukocytes; transcriptional; replicative; DNA-topoizomerase.

Миома матки представляет собой доброкачественную опухоль моноклонального происхождения, развивающуюся из гладкомышечных клеток и содержащую различное количество волокнистой соединительной ткани. Считается, что миома матки соответствует критериям истинной опухоли, о чем свидетельствуют: моноклональный характер развития миомы (как и большинство опухолей, в том числе и злокачественных), большие размеры и автономный рост опухоли, обусловленный воздействием факторов роста и цитокинов, активизация процесса неоангиогенеза, генетическая нестабильность (до 40% миом имеют генетические нарушения), т. е. вследствие мутаций нарушается четкая работа генетического аппарата и механизм репликации и транскрипции ДНК, изменяется регуляция клеточного цикла в поврежденных клетках, что приводит к неуклонной опухолевой прогрессии  [2,с.2; 3, с.1486; 6,с.107]. Изучение нарушений, происходящих в ядерном аппарате клетки, позволят  выявить опухоль  на ранних доклинических стадиях, что повышает эффективность терапии. Лечение на ранних стадиях развития миомы матки позволяет остановить развитие заболевания, привести к его регрессу и не допустить в дальнейшем нарушения репродуктивной функции. Ранее нами было проведено изучение транскрипционной и репликативной активности ДНК при миомах матки [1,с.96]. 

Основной целью данного исследования является изучение межнуклеосомной деградации ДНК до и после лечения женщин при различных формах миомы матки. 

Материалы методы исследования:

В качестве материала была использована кровь  25больных женщин с диагнозом миома матки. Критериями включения в исследование больных женщин явились: наличие миомы матки у женщин репродуктивного и пременопаузального возраста с разным развитием клинической симптоматики заболевания. Кровь в объеме 1 мл брали с помощью катетера из локтевой вены в вакуумные пробирки, содержащие 0,1мл 0,5М ЭДТА. Кровь у исследуемых женщин брали  до и после лечения.

Выделение высокомолекулярнойДНК из крови женщин с миомами матки проводили методом фенольной экстракции [4,с.1487].

Межнуклеосомная деградация ДНК

Анализ межнуклеосомной деградации ДНК. К 1мл периферической крови добавляли 4мл стерильной Н₂О, затем пробы инкубировали при комнатной температуре 2ч. Клетки лейкоцитов (2х10⁶), осаждали при 3 тыс. об/мин, 4⁰С, в течение 15 мин. Надосадочную жидкость аккуратно удаляли, к желто-красному осадку ядер лейкоцитов добавляли 1мл лизирующего буфера (20 мМTris-HCl, рН 7,4; 0,35М NaCl; 1% SDS, 2 мМ MgCl₂, 1мМ дитиотрейтол), лизис проводили надо льдом 3 мин. Затем в пробы добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), мягко экстрагировали на качалке в течение 15-20 мин при 160 об/мин. Пробы центрифугировали 10 мин при 5тыс.об./мин, 4⁰С. Затем водную фазу отбирали в новые пробирки, добавляли равный объем хлороформа, мягко экстрагировали на качалке в течение 15-20 мин при 160 об/мин, затем пробы центрифугировали 10 мин при 5тыс.об./мин, 4⁰С. Водную фазу отбирали в новые стерильные пробирки, добавляли 1/10 объема 3М раствора ацетата натрия, 5 объемов 96% этанола и оставляли на ночь, – 20⁰С.ДНК осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 13 тыс. об/мин. Удаляли супернатант, промывали осадок 70% этанолом и повторно центрифугировали в течение 15 мин при 10тыс. об/мин, 4⁰С. Осторожно отбирали раствор этанола из пробирок, осадок ДНК подсушивали при комнатной температуре в ламинар боксе. Затем препараты ДНК растворяли в 500мкл ТЕ буфера рН 7,6 (10мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, рН 8,0), добавляли РНКазу А (100мкг/мл) и инкубировали при 37⁰С в течение 3ч. Затем пробы экстрагировали два раза смесью фенол – хлороформ (1:1). Затем пробы центрифугировали при 5тыс. об/мин, 4⁰С, 15мин, осторожно отбирали надосадочную жидкость в новые пробирки. Качественный анализ и электрофоретическую подвижность ДНК анализировали в 1,5% агарозном геле, 1,5ч, 100В. Затем гель фотографировали в проходящих лучах УФ.  

Фракционирование препаратов ДНК  в агарозном геле проводили по методу Шарпа [8,с.107]. Агарозный гель готовили следующим образом:  необходимое количество агарозы растворяли при нагревании на водяной бане в буфере, содержащем 0,04М трис-НС1  (рН  7,5),  0,005М ацетат натрия,  0,001М ЭДТА. Буфер такого же состава использовали в качестве электродного. Раствор агарозы охлаждали до  50⁰ С, заливали в прибор для электрофореза (толщина слоя геля составляла 3 мм). Пробы после рестрикции смешивали с сахарозой, ЭДТА  и  красителем бром феноловым синим (конечные концентрации составляли 5%,  0,01 М  и  0,004%, соответственно) и наносили на поверхность геля. Электрофорез проводили в течение ночи при комнатной температуре при напряжении 1 В/см геля.  Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 30-40 минут и просматривали под ультрафиолетовым светом.  В качестве маркера для определения молекулярного веса фрагментов ДНК использовали ДНК  бактериофага .

Анализ активности ДНК - топоизомеразы II. Суспензию клеток лейкоцитов ресуспендировали и отмывали в 1мл среды Игла, содержащей 1% эмбриональную телячью сыворотку. Титр живых клеток  анализировали в камере Горяева с использованием реагента трипан-синий. Использовали титр живых клеток 10млн/мл. Эксперименты проводили в 96-луночных планшетах. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мM L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, µM 50 этопозида, в течение 4 часов при 37⁰С, 5% СО₂ в СО₂ инкубаторе. В контрольные варианты этопозид (ингибитор топоизомеразы II) не добавляли. Затем клетки осаждали при 3000  об/мин при 4⁰С в течение 15мин. Надосадочную жидкость аккуратно удаляли, к осадку клеток добавляли 100мкл лизирующего буфера (10мМ Трис-HClpH 7.4, 10мМ ЭДТАpH 8.0, 0.5% Тритон Х-100), лизис проводили надо льдом 3 мин. Пробы центрифугировали при 3000. об/мин при 4⁰С в течение 10мин и отбирали супернатант. Супернатант обрабатывали РНКазой (400мг/мл) при 37⁰С 1 час, инкубировали с протеиназой К (200мкг/мл) при 50⁰С 30мин, в пробы добавляли 20мкл 5М NaCl и 120мкл изопропанола охлажденного. Все пробы оставляли на ночь при – 20⁰С. Электрофоретический анализ ДНК проводили в 1,5%-м агарозном геле в трис-ацетатном-ЭДТА буфере, с применением стандартной концентрации этидиум бромида в течение 4 час, 60V. Гель фотографировали через проходящие лучи УФ иллюминатора. 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При миомах матки происходит развитие пролиферативных процессов, что, возможно, обусловлено апоптозом клеток. Необходимо отметить, что главным проявлением апоптоза является деградация хроматина, основой которой служит ферментативное расщепление ДНК. Расшепление ДНК происходит в несколько этапов с формированием все более мелких фрагментов, размером 700, 200-250, 50-70, 30-50 тыс. пар оснований. На последней стадии происходит конденсация хроматина. Очередной этап деградации ДНК является  широко принятым опознавательным признаком апоптоза — это межнуклеосомная дезинтеграция ДНК, т. е. разрывы нитей ДНК, находящихся между нуклеосомами.  При этом образуются фрагменты, кратные по величине 180-190 пар оснований, что соответствует протяженности нити ДНК в пределах одной нуклеосомы. На рисунке 1 представлены результаты электрофоретического анализа межнуклеосомной деградации ДНК. Из данных рисунка видно, что до лечения женщин с миомами матки наблюдается заметная фрагментация ДНК и межнуклеосомная деградация (дорожки 2,5,8,11,12,13,14 и 15). Возможно,  при формировании миомы матки в женском организме  нарушена формула крови  и происходит активизация процесса  апоптоза. Известно, что при апоптозе происходит нарушение структуры хроматина, которое проявляется в межнуклеосомной деградации ДНК, т.е. происходят  разрывы нитей спейсерной ДНК, которая связывает  нуклеосомы.  После лечения происходит восстановление   нативности молекулы ДНК и уменьшение межнуклеосомной деградации ДНК женщин с миомами матки. Из данных рисунка 1 видно, что после лечения происходит полное восстановление  нуклеосомной деградации и молекула ДНК полностью восстанавливается, т.е.  наблюдается 100% нативность молекул ДНК (дорожки 16 -22 и  25 – 29).

Рисунок 1. Анализ межнуклеосомной деградации ДНК лейкоцитов крови до и после лечения женщин при различных формах миомы матки

Дорожки 1-15 до лечения. Дорожки 16-30 после лечения.  М – маркерλ/HindIII (23,1; 9,4; 6,6; 4,3; 2,3; 2,0 размер фрагментов т.п.н.). 1,5% агарозный гель, 1,5ч, 100В. Дорожки 1 и 2, соответственно образцы ДНК лимфоцитов взятой у одного и того же пациента, такое же соответствие дорожек в очередности с другими образцами ДНК.

Межнуклеосомная деградация ДНК отражает первичный уровень укладки хроматина в виде нуклеосом. Связь между фрагментацией ДНК и ее транскрипцией остается достаточно противоречивой. Мы попытались уточнить механизм зависимости процесса транскрипции от межнуклеосомной  деградации ДНК. Известно, что топоизомераза II расщепляет ДНК у основания топологических доменов. Топоизомераза вносит разрыв в ДНК (однонитевой в случае топоизомеразы I, или двунитевой в случае топоизомеразы II). По ходу ферментативного цикла данный фермент вносит  разрывы в молекулу ДНК т.е. приводит к релаксации суперспирали ДНК. На промежуточной стадии реакции (во время существования разрыва) фермент остается ковалентно связанным с ДНК. Известно, что индуцированные топоизомеразой II двухцепочечные разрывы распознаются клеточными системами мониторинга целостности ДНК с небольшой задержкой. Исходя из этого, представляло интерес, определить приводит ли подавление лигазной активности топоизомеразы II к сохранению двухцепочечных разрывов ДНК, которые могут распознаваться репарационными системами клетки. Короткоживущий промежуточный комплекс может быть стабилизирован различными ингибиторами [7,с.67; 9, с.430]. Одним из широко используемых ингибиторов топоизомеразы II является этопозид, который является ингибитором лигазной активности топоизомеразы II. При обработке клеток этопозидом двунитевые разрывы  в ДНК, которые вносит топоизомераза II, сохраняются [5,с.2616]. Ингибирование активности тoпoизомеразы II этопозидом дает возможность обнаружить  полиморфизм длины фрагментов ДНК от 200 до 10000 пар  нуклеотидов.   ДНК-топоизомераза участвует в процессах репликации, транскрипции и рекомбинации ДНК.

На рисунке 2. представлены результаты по топоизомеразной активности в лейкоцитах крови женщин при миомах матки до лечения. Из данных рисунка видно, что во всех исследуемых  препаратах ДНК наблюдается нарушение ее нативности до 70% и образуются фрагменты, размером  9-15 т.п.н.  При быстрорастущей миоме матки  происходит наибольшая фрагментация ДНК (дорожки 5,6).

Рисунок 2. Анализ активности ДНК-топоизомеразы II в клетках лейкоцитов крови взятой у женщин с различной патологией миомы матки

Дорожки: 1,2 – простая миома(ПРМ); 3,4 – симптом кровотечения (СК); 5,6 – быстрорастущая, прогрессирующая миома (БРМ). М – маркер, ДНК- λ/HindIII (23.1, 9.4, 6.6, 4.3, 2.3, 2.0, 0.56 т.п.н.). А, Б – интактные клетки лейкоцитов. В, Г - клетки лейкоцитовобработанные µM 50 этопозидом, 37⁰С, 4ч. Электрофорез проводили в 1,5%-м агарозном геле, 60V, 4ч. 

На рисунке 2Б представлены результаты по топоизомеразной активности в лейкоцитах крови женщин при миомах матки до лечения с использованием этопозида. По данному рисунку видно, что во всех пробах ДНК почти полностью расщеплена на фрагменты с молекулярной массой от 0,5 до 23,0 т.п.н. и выше.  На электрофореграмме расщепленные фрагменты ДНК проявляются в виде лестницы. 

На рисунках 2В и 2Г представлены результаты по изучению активности топоизомеразы в лейкоцитах крови женщин при различных миомах матки после лечения. На электрофореграмме видно  (дорожки 1-6), что во всех исследуемых образцах ДНК  наблюдается 100%  нативность структурной организации ДНК с молекулярной массой  23,1 т.п.н.

Превращения обратимых разрывов в необратимые  происходят при транскрипции тех локусов, в которых образуются ковалентный комплекс между топоизомеразой II и ДНК. В результате транскрипции происходит эпигенетическая модификация хроматина, что делает более доступным его для действия нуклеаз  и топоизомеразы II. При транскрипции происходит временное нарушение интегральности ДНК, в результате чего образуются двойные разрывы, которые запускают процесс  репликации и транскрипции ДНК.

На основании полученных данных можно придти к выводу, что восстановление структуры ДНК   в лейкоцитах крови при ПРМ, СМ и БРМ возможно связано с эффективностью лечения при данной патологии.

Таким образом,  при различных миомах матки происходят нарушения в транскрипционной и репликационной системах лейкоцитов периферической крови, причиной которых являются межнуклеосомная  деградация ДНК и изменение активности ДНК- топоизомеразы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что при  ПРМ, СМ и БРМ происходит нарушение синтеза ДНК и РНК.
2. Установлено, что  нарушение репликационной и транскрипционной активности ДНК зависит от межнуклеосомной деградации ДНК и  высокой активности  топоизомеразы II.
3. Показано, что после лечения агонистами гонадолиберинов при  ПРМ, СМ  и БРМ восстанавливается структура ДНК, а активность ДНК-топоизомеразы II уменьшается.

Список литературы:

1. Исанбаева Л.М., Кадырова Д.А., Харисова И.И., Альмухамедова В.М. Нарушение процессов репликации и транскрипции ДНК при миомах матки //Новости дерматовенерологии и репродуктивного здоровья.-2011,№1.-С.96-98.
2. Сидорова И.С. Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения)// М.: Медицинское информационное агентство.- 2002.- 256 с.
3. Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М. Современные представления об этиологии и патогенезе миомы матки.//Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. -2004.-Т.3.- №6.-С.62-68.
4. Шипицинa Г.И., Атаханова Б.А., Кадырова Д.А., Туракулов Я.Х. Выделение тиреоглобулиновой мРНК из клеток узлового эутиреоидного зоба человека и синтез комплементарной ей ДНК//ДАН СССР.- 1988.- вып.294, №8.- С.1486-1492.
5. Downes C. S., Mullinger, A. M., Johnson R. T.Inhibitors of DNA topoisomerase II      prevent chromatid separation in mammalian cells but do not prevent exit from                  mitosis// Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1991.- V.88.- P. 2616-2620.
6. Lucas J. N., Tenjin T., Straume T. Rapid human chromosome aberration analysis          using fluorescence in situ hybridisation//International J. of Radiation Biology.-2001.-       Vol. 62.-P. 53-63.
7. Nitiss J.L. Investigating the biological functions of DNA topoisomerases in eukaryotic cells//.- Biochim Biophys Acta. -1998,-V.1400.- P.63–81.
8. Sharp S. A general method for isolation of total DNA and separation by gel electrophoresis//J.Mol.Biol.Reports.-1980.- V.19, №2.- P.107-112.
9. Wang J.C. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective\\ Nat Rev Mol Cell Biol.- 2002.-V. 3.-P. 430–40.