ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ХИМИОПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Онкология остается одной из ведущих причин смертности во всем мире. В то время как современные методы терапии являются эффективными в лечении на ранних стадиях рака, эффективность в отношении прогрессирующего рака ограничена. Таким образом, разработка новых противоопухолевых агентов, которые могут воздействовать на раковые клетки , обеспечит значительное улучшение качества жизни у онкологических больных.

На практике подобное можно осуществить благодаря широкому внедрению в эксперимент альтернативных биологических моделей, в том числе культуральных. Последние высокочувствительны к воздействию малых количеств испытуемых веществ, эффект которых на организменном уровне может проявиться лишь при больших дозировках и спустя значительное время (Червонская Г.П. и др., 1998; Афиногенова А.Г. и др., 1999; Еськов А.П. и др., 2003; Flint О., 1996; Louekari К., 1996 и др.)

Методики с использованием перевиваемых клеточных линий для изучения цитотоксичности в последние годы  получили широкое распространение во многих областях медицинской деятельности, в том числе и в прикладной микробиологии. Применение коллекционных паспортизированных линий клеток с известными свойствами обеспечивает воспроизводимость результатов опытов по изучению характера биологической активности тестируемых соединений непосредственно на клеточном уровне, позволяет оценивать состояние клеток-мишеней прижизненно. К достоинствам этих методов относятся также возможность одновременного тестирования большого числа биологически активных полимеров при их минимальном расходе и получение результатов проверки в течение относительно короткого промежутка времени (Вечканов Е.М., Сорокина И.А., 2012).

Цель исследования :

1.     Исследование цитотоксичности химиопрепаратов на перевиваемые и опухолевые клетки для возможного дальнейшего лечения больных онкологией.

Задачи исследования :

1.     Подбор условий на подготовительном этапе, получение 2/3 монослоя культуры клеток для исследования химиопрепаратов.

2.     Определить титр препарата , при котором наблюдается цитотоксическое действие на перевиваемые и опухолевые клетки через 72 часа.

3.     Определить титр препарата , при котором наблюдается цитотоксическое действие на перевиваемые и опухолевые клетки через неделю.

4.      Провести сравнительную оценку цитотоксического действия химиопрепаратов.

Материалы и методы исследования:

В работе были использованы следующие материалы и реактивы : питательная среда ДМЕМ (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Чумакова РАМН), раствор Версена, сыворотка плода коровы.

Клеточные культуры Vero Е6 (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки) , СПЭВ (клетки почки свиньи), Mel 8 (клетки меланомы), 293 А (клетки почки  эмбриона человека) были получены из банка культур клеток ГНЦ ВБ "Вектор" и поддерживались на среде Игла DМЕМ (Gibco BRL), содержащей 10% сыворотки плода коровы (Gibco BRL), 2мМ L-глютамина и 80 мкг/мл сульфата гентамицина в культуральных пластиковых флаконах ( Costar ,США).

В качестве химиопрепаратов были использованы препараты, производные имидазола(ЛПП-205,ЛПП-206, ЛПП-207) и противоопухолевые препараты, которые были любезно предоставлены Тихоновым А.Я. (Институт органической химии СОРАН).

В культуральный флакон с клеточной культурой вносят по 1мл раствора Версена (предназначен для отделения со стекла монослойной культуры клеток), и оставляют при температура 35-37 °С на 1-2 мин., после чего клетки отделяют от стекла, встряхивая флакон. Далее вносят 5 мл среды DMEM 7%, суспензируют .

Затем в стандартные стерильные планшеты с 96 лунками, находящиеся в асептических условиях, последовательно вносились культура  клеток по 50 мкл в лунку и химиопрепараты в разных разведениях по 100 мкл на лунку в поддерживающей среде (ДМЕМ, 2 % фетальной сыворотки). Для каждого испытуемого препарата бралось 3 повтора, в семи разведениях и 3 лунки для контроля.

Лунки для испытания препаратов и лунки для контрольных образцов располагались на одной планшете.

В стандартном тесте химиопрепараты, подлежащие испытанию на цитотоксичность, добавляются в лунки основной группы образцов клеточных культур в концентрациях, заранее оговоренных протоколом эксперимента.

В лунки с контрольными образцами клеточных культур не добавляется ничего, – в них находится только клеточная культура и питательная среда.

Затем планшеты с основной группой образцов клеточных культур, в которые добавлены химиопрепараты, и группой контроля на 72 часа помещаются в эксикатор (обеспечивает 5% СО₂), а эксикатор в термостат (37⁰ С), фиксируют цитотоксичность препаратов, затем повторно помещают на 72 часа.

Через первые 72 часа проводится сравнительное изучение клеточных культур основной и контрольной группы под микроскопом, далее проводится аналогичное сравнение с окончательным результатом.

Результаты и обсуждения

Таблица 1.

Определение цитотоксичности исследуемых препаратов в отношении перевиваемых (VeroE6,SPEV,293A) и опухолевых клеток (Mel 8) через 72 часа

Таблица 2.

Определение цитотоксичности исследуемых препаратов в отношении перевиваемых (VeroE6,SPEV,293A) и опухолевых клеток (Mel 8) через неделю

Таким образом , нами было показано, что препараты производные имидазола (205, 206, 207) вызывают цитотоксичность клетки в больших разведениях. Эти препараты в минимальных дозах способны убить «бессмертную» опухолевую клетку (Mel8). Для проведения дальнейших исследований противоопухолевой активности наиболее перспективными являются химиопрепараты 205, 206, 207. Эти препараты

Выводы:

1. До начала основных экспериментов был выполнен подготовительный этап работы, включавший ряд последовательных разделов: определение сроков адаптации клеточных линий к предлагаемым условиям выращивания, определение сроков формирования 2/3 монослоя для титрования химиопрепаратов и предельно допустимого срока наблюдения за культурами в условиях отсутствия признаков истощения среды выращивания.

2 Химиопрепараты обладают достаточно выраженным цитотоксическим эффектом in vitro.

3. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований противоопухолевой активности химиопрепаратов.

Список литературы:

1. Аксенова П.В , Айбазов А.М .,Среда для культивирования доимплантационных эмбрионов коз in vitro. Патент РФ 2010.
2. Кирилюк И.А., Святченко В.А., Морозов Д.А., Казачинская Е.И., Киселев Н.Н., Войнов М.А., Локтев В.Б., Григорьев И.А., Бакунова С.М. Цитотоксичность нитроксильных радикалов в отношении опухолевых и диплоидных клеток человека in vitro и оценка их противовирусной активности, 2012
3. С.В. Горбенко, А.Е. Кудаев, К.Н. Мхитарян, Н.К. Ходарева, Влияние информационных препаратов на культуры опухолевых клеток in vitro, 2006г.
4. Тертичная  М.В., Использование клеточных культур при изучении действия Т-2 токсина, 2005
5. Chen J, Ahn S, Wang J, Lu Y, Dalton JT, Miller DD, Li W. Discovery of novel 2-aryl-4-benzoyl-imidazole (ABI-III) analogues targeting tubulin polymerization as antiproliferative agents. Journal of medicinal chemistry.2012;55(16):7285–7289