ИЗУЧЕНИЕ ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКТИНОВ KOLANCHOE BLOSSFELDIANA, CHELIDONIUM MAJUS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ

Усачев Степан Александрович

студент, кафедра биохимии и биотехнологии

Башкирский государственный университет

г. Уфа

Ямалеева Анна Александровна

д-р биол. наук, профессор

кафедра биохимии и биотехнологии

Башкирский государственный университет, г. Уфа

E-mail:nuggetus@mail.ru

В последние годы значительно расширился научный и практический интерес к поиску и использованию природных средств, обладающих противомикробной, противовирусной и иммуностимули­рующей активностью. В значительной степени этому соответствуют лектины, которые являются сложными белками, металлосодержащими гликопротеидами [6, 7].

Лектины — (от лат. lego — выбираю), белки, обладающие свойством специфично и обратимо связывать углеводы или их остатки в биополимерах (напр., в гликопротеинах). В зависимости от источника получения различают бактолектины, миколектины, фитолектины и зоолектины. Лектины входят в структуру тканей, принимая участие в регуляции и защите организма от внешних стрессоров. Выделенные из различных организмов лектины уже широко используются как реактивы в биохимии, гистохимии, диагностике некоторых заболеваний. В последние годы делаются попытки использования лектинов и в качестве лекарственных препаратов. Все сказанное о лектинах привлекает к их изучению исследователей, работающих в разных областях биологической науки, и прежде всего в биохимии, цитологии, микробиологии, физиологии растений, биотехнологии и фармации. У лектинологии — науки, развивающейся на стыке различных биологических дисциплин, большое будущее [4].

Одним из интереснейших свойств лектинов является их способность к реакции гемагглютинации с эритроцитами (фитогемагглютинация), и это свойство можно изучать in vitro. Связана такая реакция лектинов с тем, что они обладают углеводной специфичностью к определенным рецепторам эритроцита.

На поверхности эритроцита имеются олигосахаридные цепи, состоящие из моносахаридов. Разнообразие моносахаридов очень велико, однако чаще всего в состав этих олигосахаридов входят глюкоза (Glc), N-ацетилглюкоза (NAcGlc), галактоза (Gal), N-ацетилгалактоза (NAcGal), манноза (Man), фукоза (Fuc), N-ацетилнейраминовая или сиаловая кислота (NAcNeu). Различные моносахара, соединяясь в определенную последовательность, образуют олигосахарид, который присоединяется одним концом к белковой молекуле, погруженной в липидный матрикс мембраны. Олигосахариды мембранных белков служат своеобразными лигандами для связывания с лектинами, вызывая разнообразные эффекты в процессах функционирования мембраны. При этом, процесс взаимодействия с определенными углеводными остатками происходит с определенными лектинами [4].

Синтез и выделение лектинов из растений является менее дорогостоящим и более простым по сравнению с лектинами животного происхождения, а селективность связывания с углеводными детерминантами также очень высока, что позволяет использовать их для оценки морфофункционального состояния органов и тканей на основании анализа рецепторного состава клетки (в диагностике) и в качестве лекарственных препаратов.

Для изучения биохимической активности и общей характеристики лектинов на начальных этапах научного поиска применяется, прежде всего, реакция гемагглютинации с эритроцитами различных групп крови, что позволяет сделать вывод не только о содержании лектинов в исследуемом растении, но и о степени их биологической активности. С помощью реакции гемагглютинации лектиновая активность была обнаружена в экстрактах пыльцы различных видов из 30 отрядов семенных растений, включая представителей голосеменных, двудольных и однодольных [10], в надземных побегах более 2000 видов растений [9]. Установлена вариабельность уровня лектиновой активности в органах фасоли (Phaseolus L.), картофеля (Solanum L.), яблони (Malus Mill.) и растений многих других родов в онтогенезе в зависимости от фазы развития [2,5,11], что связывают с функциональной активностью гемагглютинирующих белков. Лектиновая активность различных органов растений может значительно отличаться. Например, у жарновца метельчатого (Sarothamnus scoparius L.), можно наблюдать соотношение активностей экстрактов из коры, семян, листьев и цветков соответственно 512: 64: 1: 1 Аналогичные соотношения обнаружены и у других растений, например у отдельных видов караганы (Caragana Lam.), робинии (Robinia L.), ракитника (Cytisus L.) [1]. Биологический смысл разного рода изменений динамики активности лектинов и их отличий по углеводной специфичности, как у отдельных видов, так и на примере растений из разных систематических групп не до конца изучен.

Объектом исследований на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета были выбраны растения, которые имеют многовековой опыт применения в народной и нетрадиционной медицине — Kolanchoe Blossfeldiana и Chelidonium Majus. Эти растения недостаточно изучены с точки зрения биохимии и медицины, хотя лектиновая активность была обнаружена у вида Kalanchoe Adans [3].

Целью данных исследований было выделить фитолектины из исследуемых растений, находившихся в различных условиях окружающей среды, определить их наибольшую гемагглютини­рующую активность с эритроцитами разных групп крови в зависимости от условий среды растений, в отдельности и при совместном исследовании РГА. Данная цель стала первым этапом для дальнейшего изучения биохимических свойств фитолектинов Kolanchoe Blossfeldiana и Chelidonium Majus в перспективе их применения в медицинской практике.

Материалы и методы:

Для обнаружения фитолектинов и их количества в растительном сырье (свежие гомогенизированные листья Kolanchoe Blossfeldiana), опытные растения Kolanchoe Blossfeldiana были разделены на 3 группы, в зависимости от условий окружающей среды: первая группа не подвергалась воздействию неблагоприятных факторов (экспозиция 3 суток, +18⁰С, умеренная дневная освещённость, влажность воздуха 50%), вторая группа была помещена на холод, в темноту (экспозиция сутки, +4⁰С, холодильная камера без освещения, влажность воздуха 30%), третья группа была подвергнута высыханию (экспозиция в сухом субстрате 3 суток, +18⁰С, умеренная дневная освещённость, влажность воздуха 50%).

Растительным сырьем Chelidonium Majus стали семена, которые были разделены на две группы: первая группа не подвергалась воздействию неблагоприятных факторов (экспозиция 3 суток, +18⁰С, умеренная дневная освещённость, влажность воздуха 50%), а вторая группа была подвергнута стратификации (на 10 суток в торфе, +4⁰С, холодильная камера без освещения, влажность воздуха 30%).

Для выделения и очистки фитолектинов листья Kolanchoe Blossfeldiana, семена Chelidonium Majus суспензировались и заливались ацетатным буфером (рН 3,8), помещались в холод 4⁰С на 12 часов, а затем центрифугировались при 3000 об/мин — 15 мин. Далее использовался супернатант.

Содержание фитолектинов в исследуемых растениях определялось методом Лоури.

Анализ лектиновой активности проводился по реакции гемагглютинации с эритроцитами разной групповой принадлежности крови, взятой у практически здоровых волонтеров.

Анализ результатов и выводы:

Для интерпретации результатов работы и достоверности исследований (каждый опыт проводился с 10 волонтёрами каждой группы крови — всего участвовало 40 волонтёров), была проведена статистическая обработка данных с помощью пакета программ «Statistika for Windows», для статистического анализа данных использовались методы, предусматривающие определение среднеарифметических параметров и ошибок. На основании полученных данных построена гистограмма, сделаны выводы.

По результатам определения количества лектинов по методу Лоури, в исследуемых растений содержится большое количество белков, включая лектины (Kalanchoe blossfeeldiana 32,5 мг/г сухого вещества, ChelidoniumMajus 5,1 мг/г сухого вещества).

В исследуемых растениях обнаружена высокая активность лектинов. Показано, что лектиновая активность в реакциях гемагглютинации зависит от групповой принадлежности эритроцитов, что связано с различным химическом строением рецепторов клеток и объясняется различной углеводной специфичностью данных растений.

Этот факт подтверждается в РГА с использованием комбинации лектинов двух растений (активность лектинов резко повысилась, что объясняется действием разных лектинов на разные рецепторы эритро­цитов). Подтверждено положение о том, что лектиновая активность в растениях и их количество зависит от действия неблагоприятных факторов внешней среды (условия гипотермии и засухи).

Наибольшая лектиновая активность Kalanchoe blossfeeldiana отмечена с эритроцитами первой группы крови, а Chelidonium Majus с третьей группой крови.

В связи с подтверждением гипотезы, поставленной в начале эксперимента, планируется дальнейшее изучение свойств фитолектинов данных растений для возможности их применения в медицинской практике.

Список литературы:

1.        Антонюк В. О. Лектини та їх сировинні джерела. — Львів, 2005. — 554с.

2.        Антонюк В. А., Луцик М. Д., Ладная Л. Я. Сезонные изменения титра гемагглютинации и сродства к углеводам экстрактов растений, содержащих фукозоспецифичные лектины // Физиология растений. — 1982. — 29, № 6. — С. 1219‑1224.

3.        Евтушенко А. И. Антивирусные свойства лектинов каланхое: Изучение и применение лектинов // Уч. зап. Тартус. ун-та. — 1989. — 2, вып. 870. — С. 189‑192.

4.        Игнатов В. В. Углеводузнающие белки – лектины //Соросовский образовательный журнал, №2, 1997.

5.        Кириченко О. В., Тищенко О. М. Вплив екзогенного специфічного лектину на лектинову активність у проростках та листках пшениці // Укр. біохім. журн. — 2005. — 77, № 4. — С. 133‑137.

6.        Корсун В. Ф., В. М. Лахтин, Е. В. Корсун, А. Мицконас Фитолектины, М., Издательство: «Практическая Медицина», 2007. — 288с.

7.        Корсун В. Ф., Корсун Е. В. Использование фитолектинов в терапии больных псориазом. Вестник фитотерапии ФПКМР РУДН, Москва, 2004.

8.        Погорелая Н. Ф., Капля А. В., Брайон А. В., Киндрук Н. Л. Лектиноподобная активность белоксодержащих экстрактов почек яблони в зимний период // Физиология и биохимия культ. растений. — 1991. — 23, № 6. — С. 594‑597.

9.        Ямалеева А. А. Лектины растений и их биологическая роль. — Уфа: Изд-во Башк. ун-та, 2001. — 204 с.

10.     Carratu G., Giannattasio M. Lectin activity in pollen from plants representative of thirty orders of spermatophyta // Sex Plant Reprod. — 1990. — 3, № 1. — P. 35—40.

11.     Moseshvili N., Aleksidze N. Distribution of soluble proteins with lectin activity in different organs of Mentha pulegium and biological characteristics // Bull. Georg. Acad. Sci. — 1999. — 160, № 2. — P. 327‑330.