ГЛУТАТИОН-ЗАВИСИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ В КРОВИ БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

GLUTATHIONE-DEPENDENT ENZYMES IN THE BLOOD OF PATIENTS WITH MAMMARY TUMORS

Ludmila Gavriliuc

doctor of medical science, Professor, N. Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy,

Moldova, Chisinau

Natalia Botnariuc

candidate of medical science, Senior Researcher, Oncologic Institute of Moldova,

Moldova, Chisinau

Boris Tihii

student of the 6 cours of General Medicine Department, N. Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy,

Moldova, Chisinau

АННОТАЦИЯ

Антиоксидант глутатион и глутатион-зависимые ферменты, глутатионредуктаза и глутатионтрансфераза, являются ингибиторами перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и факторами, необходимыми для деления и дифференцировки клеток. В исследовании участвовали 56 пациентов с опухолями молочной железы до начала лечения и 20 здоровых женщин, у которых в сыворотке крови определяли содержание глутатиона и активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы. Найденные отличия активностей антиокислительных глутатион-зависимых ферментов-маркёров у больных с доброкачественными и злокачественными (рак) опухолями молочной железы могут рассматриваться в качестве дополнительного биохимического теста к цитоморфологическому анализу при дифференциальной диагностике опухолей молочной железы.

ABSTRACT

The antioxidant glutathione and glutathione-dependent enzymes, glutathione reductase and glutathione transferase, are inhibitors of lipid peroxidation (LPO) of the cell membranes and the factors, which are necessary for cell division and differentiation. The study involved 56 patients with mammary tumors before treatment and 20 healthy individuals. The content of reduced glutathione and activity of glutathione reductase and glutathione transferase were determined in the blood serum of patients. The differences of the activity of the antioxidant glutathione-dependent enzymes as biomarkers in patients with benign and malignant (breast cancer) tumors may be considered as an additional biochemical test to cytomorphological analysis in the differential diagnosis of breast tumors.

Ключевые слова: глутатион; глутатионредуктаза; глутатионтрансфераза; опухоли молочной железы.

Keywords: glutathione; glutathione reductase; glutathione transferase; mammary tumors.

По оценкам экспертов ВОЗ, в мире ежегодно регистрируют от 800 тысяч до 1 млн. новых случаев заболевания раком молочной железы. Наиболее высокая частота заболевания наблюдается в развитых странах, причём, возникновения доброкачественных опухолей значительно выше, чем злокачественных во всех странах. Онкологические заболевания занимают второе место по численности летальных исходов после сердечно-сосудистых патологий. Согласно сведениям онкологов Отделения Маммологии Онкологического Института Молдовы, количество больных с опухолями молочной железы за последнее десятилетие увеличилось [1, с. 182].

Рак молочной железы – многофакторное заболевание, развитие которого связано с изменением генома клетки под воздействием внешних факторов и гормонов [1, с. 182; 2, с. 383–384]. Хорошо известно, что мутации BRCA гена подтверждают риск развития рака молочной железы в 60–85 % случаев и риск возникновения рака яичников (15–40 %). Наиболее выраженными генетическими факторами предрасположенности к раку молочной железы считают гены BRCA1 и BRCA2. Канцерогены способствуют образованию дополнительных химических связей в двойной спирали ДНК, в результате чего происходит повреждение участков, содержащих BRCA1 и BRCA2. Аналогичную роль играют и гены АТМ, ТР53 (ген белка 53), PTEN [2, с. 371].

Растущая опухоль изменяет иммунореактивность организма, понижает иммунологические функции, продукцию антител и других естественных иммунных факторов. Рост клеток опухоли сопровождается изменением регуляции свободно-радикальных процессов и содержания перекисей в липидах клеточных мембран.

Биоантиоксиданты являются ингибиторами перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и факторами, необходимыми для деления и дифференцировки клеток. Водорастворимый антиоксидант-глутатион и его ферментная редокс-система играют важную роль в этих процессах и в метаболизме клеток. Восстановленный глутатион и глутатионзависимые ферменты (глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза и др.) выполняют важную функцию в интегративной системе организма, способствуя клеточной адаптации к окислительному стрессу [2, c. 369; 7, c. 579; 9, c. 13291–92]. Координация этого ответа выполняется благодаря антиоксиданту, который был найден в промоторах многих генов, и индуцируется окислительным и химическим стрессом. Активация гена ведёт к вовлечению антиоксидантов в процессы защиты здоровых клеток, находящихся под влиянием многих агентов, предупреждающих их трансформацию и развитие рака [7, c. 582].

В клетках многих опухолей содержание глутатиона повышается, что способствует усилению опухолевого роста. Поэтому, одной из важных задач для лечения больных с опухолями является поиск лекарств-ингибиторов глутатиона, которые блокируют его метаболические эффекты в опухолях. Содержание глутатиона, как фактора роста, может быть показателем (биомаркёром) для контроля лечения пациента.

Глутатионредуктаза (ГР) является единственным ферментом, восстанавливающим окисленный глутатион (GSSG) в его восстановленную форму (GSH), составляющую 90–95 % от общего содержания глутатиона в клетках организма.

Глутатионтранфераза (ГТ) также играет важную роль в антиокислительной защите организма от токсичных ксенобиотиков, эндотоксинов, катализируя с использованием глутатиона реакции конъюгации, обезвреживая токсины. Защищая клетку от токсинов, во время химиотерапии опухолей часто происходит повышение её активности, что приводит к лекарственной устойчивости опухолевых клеток к препарату. Поэтому, поиск препаратов, ингибирующих активность ГТ в опухолевых клетках, также является одной из важных задач клинической онкологии.

Принимая во внимание важную роль глутатиона и глутатион-зависимых ферментов в процессе опухолевого роста, было решено провести их исследование у пациентов с первичными опухолями молочной железы до начала лечения.

Цель исследования: провести сравнительный анализ уровней активностей глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и содержания восстановленного глутатиона в сыворотке крови больных с опухолями молочной железы.

Материал и методы исследования.

В исследовании участвовали 56 пациентов с опухолями молочной железы, которые впервые обратились за консультацией в отделение Маммологии Онкологического Института Молдовы. После установления диагноза пациенты были разделены на 2 группы: больные с доброкачественными опухолями молочной железы, ДМЖ (аденома, фиброаденома) и злокачественной опухолью (рак) молочной железы (РМЖ). Контрольной группой были 20 здоровых пациентов соответствующего возраста. Все исследования проводили до начала курса лечения в соответствии с правилами этики. Кровь брали утром и центрифугировали при 3 000 оборотов/мин в течение 15 минут для получения сыворотки. На спектрофотометре “Humalyzer 2000” (Германия) с помощью микрометодовв сыворотке крови определяли активность глутатионредуктазы (ГР, К.Ф. 1.6.4.2) методом Horn H.D. [5, c. 877–78], активность глутатионтрансферазы – методом Habig W. еt al., [4, c. 7136–37]. Содержание восстановленного глутатиона (ВГ) определяли с помощью метода Sedlak J., Lindsay R. [11, c. 202] и содержание белка – методом А. Лоури. Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента с использованием пакета прикладных программ Microstat: Microsoft Excel 2007.

Результаты исследований и их обсуждение.

Глутатионредуктаза (ГР). Активность ГР в сыворотке крови пациентов с опухолями молочной железы представлена на рис. 1. У больных с доброкачественными опухолями молочной железы (ДМЖ) активность фермента была равной 146,2 МЕ/л сыворотки крови, составляя 147,5 % (р<0,05) от активности у здоровых людей. Активность ГР в сыворотке крови у больных с раком молочной железы (РМЖ) была 79,9 МЕ/л (80,6 %; р<0,05). На рис. 2 представлены результаты удельной активности ГР в сыворотке крови в расчёте на г белка (МЕ/г). Активность фермента у пациентов с ДМЖ была в 7,5 раз выше активности в контрольной группе. А активность у больных с РМЖ составляла 288,3 % (р<0,05) в сравнении с контролем. Нетрудно заметить, что у пациентов с ДМЖ активность ГР была значительно выше, чем у пациентов с РМЖ при обоих способах расчёта.

Рисунок 1. Активность ГР в сыворотке крови

Рисунок 2. Удельная активность ГР в сыворотке крови

Глутатионтрансфераза (ГТ). Активность фермента в л сыворотки крови (рис. 3) у больных с ДМЖ соответствовала 138,7 % (р<0,05) в сравнении со здоровыми, а у больных с РМЖ – 85,8 % (р>0,05). Удельная активность ГТ в сыворотке (рис. 4) пациентов с ДМЖ была повышенной в 5,9 раз (р<0,01), а с РМЖ – в 2,4 раз (р<0,01).

Рисунок 3. Активность ГТ в сыворотке крови

Рисунок 4. Удельная активность ГТ в сыворотке крови

Nguyen T.Р. и сотр. показали, что индукция активности ГТ осуществляется на уровне генов, и в этом большую роль играет ВГ [9, c. 13292]. С ростом опухоли возрастает защитная роль ГТ, поэтому в ДМЖ её активность повышается [6, c. 191]. Некоторыми авторами был сделан вывод, что полиморфизм ГТ М1 ассоциирован с возникновением РМЖ, поэтому в раковых клетках активность ГТ понижена [7, c. 583]. Garcia-Closas M. и соавт. [3, c. 1962] обнаружили полиморфизм генов ГТ М1 и ГТ Т1 у больных РМЖ. Гомозиготные делеции этих генов способствовали уменьшению количества ГТ или даже её отсутствию в раковых клетках. В нашем исследовании также найдено уменьшение активности ГТ в сыворотке крови больных РМЖ по сравнению с ДМЖ пациентами.

Восстановленный глутатион (ВГ). Содержание ВГ в л сыворотки крови было выше у больных с ДМЖ (482,42 мкмоль/л) и с РМЖ (386,18 мкмоль/л; р>0,05), чем у здоровых (365,0 мкмоль/л). В расчёте на г белка содержание ВГ у пациентов с ДМЖ (26,89 мкмоль/г) было сопоставимо с его содержанием у здоровых, но у больных с РМЖ его количество было пониженным (15,38 мкмоль/г; р<0,05). Повышение содержания ВГ и активностей глутатион-зависимых ферментов наблюдали Perguin M. и соавт. [10, c. 371] в клетках первичного рака молочной железы.

Найденные отличия активностей антиокислительных глутатионзависимых энзимов-маркёров у больных с доброкачественными (ДМЖ) и злокачественными (РМЖ) опухолями молочной железы могут рассматриваться в качестве дополнительного биохимического теста к цитоморфологическому анализу при дифференциальной диагностике опухолей молочной железы.

Список литературы:

1. Годорожа Н., Пихут П., Кудина Е., Ботнарюк Н., Котруцэ А. Экспрессия HER2/neu у больных раком молочной железы. In: Actualitati in diagnosticulsitratamentulcontemporan al tumurilororganelor reproductive la femei. SinpozionNational, Chisinau, 2008, Р. 180–186.
2. Anothaisintawee T., Wiratkapun C., Lerdsitthichai R. et al. Risk factors of breast cancer: a systematic review and meta-analysis. // Asian Pacific J. Public Health, 2013, Vol. 25, № 5, Р. 368–387.
3. Garcia-Closa M., Kelsey K.T., Hankinson S.E. Glutathione S-transferase Mu and Theta polymorphisms and breast cancer susceptibility. // JNCI J. Natl. Cancer Inst., 1999, Vol. 91, № 22, Р. 1960–1964.
4. Habig W., Pabst M., Jakoby W. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation.// J. Biol. Chem., 1974, Vol. 249, Р. 7130–7139.
5. Horn H.D. Glutathione reductase. In: Bergmeyer H.-U., ed. Methods of enzymatic analysis. New York: Academic Press, 1963, Р. 875–879.
6. Kauvar K.M. Glutathione-S-transferases structure, function and clinical implifications. Edit. Van Bladeren P.J. Taylor and Fransis: London, 1996, Р. 187–198.
7. Masella R., Di Benedetto R., Vari R., Filesi C., Giovannini C. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. // J. Nutr. Biochem., 2005, Vol. 16, № 10, Р. 577–586.
8. Miyake T., Nakayama T., Naoi Y., Yamamoto N. GST P1 expression predicts poor pathological complete response to neoadjuvant chemotherapy in ER-negative breast cancer. // Cancer Sci., 2012, Vol. 103, Р. 913–920.
9. Nguyen T., Nioi P., Rickett C.B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. // J. Biol. Chem., 2009, Vol. 284, № 20, Р. 13291–13295.
10. Perguin M., Oster T., Maul A., Froment N. The glutathione-related detoxification system is increased in human breast cancer in correlation with clinical and histopathological features. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. , 2001, Vol. 127, № 6, Р. 368–374.
11. Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total, protein-bound, and nonproteinsulghydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. // Anal. Bochem, 1968, Vol. 25, № 1, Р. 192–205.