ОСНОВНЫЕ  ПРИНЦИПЫ  ИЗМЕРЕНИЯ  КАТАЛИТИЧЕСКОЙ  АКТИВНОСТИ  L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ,  ВЫДЕЛЕННОЙ  МЕТОДОМ  КЛОНИРОВАНИЯ

Бабич  Ольга  Олеговна

к.  т.  н.,  доцент

Федеральное  государственное  бюджетное  образовательное  учреждение  высшего  профессионального  образования  «Кемеровский  технологический  институт  пищевой  промышленности»,  г.  Кемерово

E-mail: 

Работа  выполнена  в  рамках  ФЦП  «Научные  и  научно-педагогические  кадры  инновационной  России»  на  2009-2013  годы,  го.  Контракт  №02.740.11.5133.

L-фенилаланин-аммоний-лиаза  (КФ  4.3.1.5)  катализирует  реакцию  обратимого  дезаминирования  аминокислоты  L-фенилаланин  до  транс-коричной  и  аммиака  [3].  Фермент  представляет  интерес  в  качестве  терапевтического  средства  для  лечения  фенилкетонурии,  может  быть  использован  как  для  прямой  терапии  фенилкетонурии,  так  и  для  производства  полноценных  продуктов  питания  не  содержащих  фенилаланин  [3;  1].  Кроме  медицинского  применения  фермент  может  быть  использован  в  биотехнологии  для  производства  L-фенилаланина  из  транс-коричной  кислоты  [2]. 

Целью  настоящей  работы  явилось  измерение  каталитической  активности  L-фенилаланин-аммоний-лиазы,  выделенной  методом  клонирования  и  экспрессии  гена  из  Rhodosporidium  toruloides  с  дальнейшим  применением  его  в  пищевой  промышленности  для  создания  функциональных  и  специализированных  продуктов  питания  для  больных  фенилкетонурией.

Определение  количественного  содержания  ферментов  в  биологических  объектах  представляет  известные  трудности,  поскольку,  за  редким  исключением,  ферменты  в  тканях  присутствуют  в  ничтожно  малых  концентрациях.  Поэтому  о  количестве  ферментов  судят  по  скорости  катализируемой  реакции  в  определенных,  согласованных  условиях  измерения.  При  оптимальных  условиях  температуры,  рН  среды  и  полном  насыщении  фермента  субстратом  скорость  катализируемой  реакции  пропорциональна  концентрации  фермента.  О  скорости  ферментативной  реакции  судят  или  по  скорости  убыли  субстрата,  или  по  скорости  образования  продукта  реакции.

Для  выражения  активности  в  практической  работе  с  ферментами  часто  пользуются  произвольными  понятиями  удельной  и  молярной  активности.  Удельную  активность  фермента  принято  выражать  числом  единиц  ферментативной  активности  на  1  мг  белка  (или  числом  каталов  на  1  кг  активного  белка).  Количество  молекул  субстрата,  подвергающихся  превращению  одной  молекулой  фермента  в  продукт  в  процессе  реакции  в  единицу  времени  при  полном  насыщении  фермента  субстратом,  принято  называть  числом  оборотов  фермента,  или  молярной  активностью

В  работе  определяли  каталитическую  активность  фермента  в  стандартных  оптимальных  условиях  при  рН  8,5  для  этого  его  разводили  в  50  раз  в  следующих  буферных  растворах:  цитрат-НCl,  ацетат-  NaOH,  КН₂РО₄-NaOH,  Трис-HCl,  Na₂B₄O₇  -  NaOH  с  рН  от  2  до  12  с  концентрацией  буфера  0,1М.  Затем  пробы  инкубировали  при  +30  °С  в  течение  10  мин  и  отбирали  и  вносили  аликвоты  в  инкубационную  среду  для  анализа.  Для  построения  диаграммы  стабильности  L-фенилаланин-аммоний-лиазы  в  зависимости  от  рН  использовали  среднее  арифметическое  значение  активности  при  соответствующем  активной  кислотности,  выраженной  в  процентах  от  активности  фермента  после  10  мин  инкубации  при  рН  8,5.  Результаты  эксперимента  представлены  на  рисунке  1.

Данные,  представленные  на  рисунке  1,  свидетельствуют  о  том,  что  L-фенилаланин-аммоний-лиаза  при  кислых  значениях  рН  (ниже  7,0)  практически  не  активен,  так  например,  при  значении  активной  кислотности  5,0  его  каталитическая  способность  сохраняется  на  83  %,  а  при  рН  4  PAL  уже  полностью  инактивировался  после  10  минутной  инкубации  при  +30°С.  Фермент  выражает  свою  стабильность  при  щелочных  значениях  среды,  так  уже  при  значении  активной  кислотности  7,0  увеличилась  по  сравнению  с  рН  5,0  в  1,2  раза.  Максимальная  активность  выделенного  фермента  наблюдается  в  интервале  активной  кислотности  8,5  до  11,5,  при  этих  значениях  рН  каталитическая  активность  составила  105  %,  т.е.  по  сравнению  с  каталитической  активностью  при  рН  5,0  она  выросла  в  1,26  раз.  По-видимому,  это  объясняется  тем,  что  ингибирование  L-фенилаланин-аммоний-лиазы  является  обратимым  и  происходит  быстрее  при  рН  11,0.

Рисунок  1.  Каталитическая  активность  L-фенилаланин-аммоний-лиазы  при  различных  значениях  активной  кислотности

Зависимость  активности  PAL  от  температуры  определяли  в  стандартной  реакционной  смеси,  которую  предварительно  выдерживали  10  мин  при  температуре  реакции.  Измерения  проводили  на  спектрофотометре  с  термостатом,  поддерживающим  нужную  температуру  с  точностью  ±0,1^оС.  Реакцию  начинали  ферментом  (10,1  мг/мл),  предварительно  разведенным  в  50  раз  0,1  М  Трис-HCl  буфером  рН  8,5.  Для  расчета  активности  фермента  использовали  линейный  участок  кинетической  кривой.  При  построении  диаграмм  применяли  средние  арифметические  значения  полученных  удельных  активностей.  Результаты  опыта  представлены  на  рисунке  2.

Рисунок  2.  Каталитическая  активность  L-фенилаланин-аммоний-лиазы  при  различных  значениях  температуры

Результаты  анализа,  представленного  на  рисунке  2,  свидетельствуют  о  том,  что  оптимальной  температурой  работы  L-фенилаланин-аммоний-лиазы  является  температура  +50°С,  именно  при  этой  температуре  реакции  наблюдается  максимальная  каталитическая  активность  (2,0  Е/мг  белка).  Также  из  диаграммы  следует,  что  каталитическая  активность  снизилась  почти  в  2,0  раза  при  повышении  температуры  реакционной  среды  до  +60  °С.  Причем  это  снижение  активности  не  может  быть  вызвано  необратимой  денатурацией  фермента.  Так,  было  показано,  что  при  данной  температуре  фермент  теряет  50  %  активности  за  15  мин,  тогда  как  время  реакции  в  данной  серии  экспериментов  составляло  4  минуты.  Это  также  подтверждается  тем,  что  во  время  реакции  не  наблюдалось  значительных  отклонений  от  линейности,  как,  очевидно,  должно  было  бы  быть  при  денатурации  белка  в  кювете.

Таким  образом,  в  результате  исследований  определена  каталитическая  активность  фермента  в  зависимости  от  различной  активной  кислотности  и  различной  температуры  реакционной  среды.  Эти  показатели  являются  очень  важными,  так  как  от  них  зависит  разработка  технологических  режимов  при  производстве  продуктов  питания  специального  назначения,  предназначенных  для  больных  фенилкетонурией.  Такие  продукты  максимально  сбалансированы  по  основным  пищевым  компонентам  и  соответствуют  физиологическим  потребностям  живого  организма,  но  содержат  минимальную  массовую  долю  аминокислоты  -  фенилаланина.

Список  литературы:

1.A  different  approach  to  treatment  of  phenylketonuria:  Phenylalanine  degradation  with  recombinant  phenylalanine  ammonia  lyase  /  C.  N.  Sarkissian,  Z.  Shao,  F.  Blain,  R.  Peevers,  H.  Su,  R.  Heft,  T.  M.  S.  Chang,  C.  R.  Scriver  //  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.-  1999.-  №96.-  Р.  2339-2344.

2.Biotransformation  of  trans-cinnamic  acid  to  L-phenylalanine:  Optimization  of  reaction  conditions  using  whole  yeast  cells  /  C.  T.  Evans,  K.  Hanna,  C.  Payne,  D.  Conrad,  M.  Misawa  //  Enzyme  Microb.  Technol.-  1987.-  №9.-  Р.  417-421.

3.Sarkissian,  C.N.  Phenylalanine  ammonia  lyase,  enzyme  substitution  therapy  for  phenylketonuria,  where  are  we  now?  /  C.  N.  Sarkissian,  A.  Gamez  //  Mol.  Genet.  Metab.-  2005.-  №86.-  Р.  22-26.